HPLC分析方法開發(fā)：分離度的認識與思考

HPLC分析方法開發(fā)：分離度的認識與思考對于色譜工作者而言，面對復雜成分的檢測，分離是首要的關注點。無法有效分離意味著無法進行準確的定性、定量檢測。中國藥典通則0500色譜法規(guī)定，高效液相色譜法、離子色譜法及氣相色譜法等要求“除另有規(guī)定外，待測物質色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應不小于1.52一、什么是基線分離？基線分離是每一個色譜分離工作者在兼顧效率前提下的終極追求。理論上，當分離度等于L5時，即可認為達到了基線分離。為什么是“即可認為。而不是絕對認為呢？這里面涉及到正態(tài)分布/高斯分布，30,6。等概念。這些概念稍顯頑固，我們給予記過并留待察看，暫不深入追究。用點色譜參數里常用的名詞，再加一點通俗語言來說就是，對稱因子為L0的兩個高矮胖瘦一模一樣的色譜峰，當分離度為L5時可認為是基線分離。比如，下圖1顯示的某藥典給出的示例圖。Peak1 Peak2圖1基線分離示例但是，理論指導實踐，實踐是檢驗真理的唯一標準。比如說，上面對于基線分離的描述情形，在實際工作中基本不可能，而且說“基本”是為了滿足“一切皆有可能”的嚴謹，否則可以直接說“根本不可能”。因為德國哲學家萊布尼茨說，世界上沒有完全相同的兩片樹葉，而每一個色譜工作者都可以說，世上沒有完全相同的兩個色譜峰。實際情況是，往往相鄰色譜峰各有千秋，導致同一個分離度會出現完全不同的分離效果。比如下圖2,兩個不同比例的色譜峰，在不同分離度情況下的分離表現，在分離度0?6時尤為明顯：當后峰是前峰的1/16時，還能看出是兩個峰嗎？JM1/16JM1/16圖2分離度及譜峰相對大小（面積）與分離度關系《實用高效液相色譜法的建立》既然如此，那我們就不要再執(zhí)念于分離度L5了，也不要自欺欺人的出具一個顯示分離度大于1.5的色譜報告而不看實際分離效果了。二、分離度如何定？很多人都做過仿制藥、改良型新藥，甚至創(chuàng)新藥！99.9%的核心技術思想離不開模仿、借鑒，還有0.1%留給那些從0到1的“傳說”。下表1列舉了從中國藥典以及歐洲藥典中隨機摘錄了一些典型的實例，對于分離要求可以說是“五花八門”。表1不同品種對于分離度的要求舉例來源品種名稱分離度要求中國藥典乙酰谷酰胺乙酰谷酰胺峰與谷發(fā)酰胺峰之間的分離度放大「7.0己酮可可堿茶堿峰與咖啡因峰的分離度應大于4,咖啡因峰與己酮回工￡減峰的分離度應大于lO.Oo馬來酸依那普利馬來酸峰與雜質I峰之間的分離度應符介要求雜質I峰、依那普利峰與雜質n峰之間的分離度應大于4.0,歐洲藥典BETAMETHASONEACETATE醋酸值他米松minimum3.3benveenthepeaksduetobetamethasoneacetateandimpurityB。醋酸依他米松峰與雜質B峰分離度應大了3.3。BETAMETHASONEVALERATE戊酸值他米松nimimuin1.7betweenthepeaksduetoimpuritiesHandD.雜質H與雜質D分離度應大于1.7oBROMOCRIPTINEMESILATE甲磺酸澳隱亭minimum1.1betweenthepeaksduetoimpuritiesAandB.雜質A與雜質B分離度應大F1.1oCLOPIDOGRELHYDROGENSULFATE硫酸履履山格宙peak-to-valleyratio:minimum10,wliereHp=heightabovethebaselineofthepeakduetoimpurityBandHv=heightabovethebaselineofthelowestpointofthecurveseppratinRthispeakfromthepeakduetoclopidogrel.峰谷比:雜質B疆氯山格雷峰之間的峰谷比應大卜lO.Oo如果說中國藥典中的例子還算中規(guī)中矩的拓寬了我們對分離度1.5的認識，那歐洲藥典分離度3.3、1.7、1.1是什么操作？這種有零兒有整兒的分離度是怎么搞出來的兒？峰谷比又是什么操作，跟分離度有什么區(qū)別，我該怎么選？看完以后什么感覺？眼花繚亂，再加上點眩暈，有點上頭！帶著一腦門兒的問號，總感覺，法典里透著點草率，嚴謹中不失那么點隨意。要不是看在歐洲藥典的面子上，領導不得罵的你找不著北？既然歐洲藥典都可以這么干，那我們能不能也模仿、借鑒一下？能！大寫的。而且，在這個彰顯個性，鼓勵創(chuàng)新的時代里，建議不要做分離度1」、3.3這種純仿制，也不要假模假式的做一些分離度1.2.3.4這種me-too,可以嘗試做一些分離度2.2、4.4這種me-better,或者大膽一點做一些分離度1.03、2.21這種四不像。三、如何證明合理性？實際工作中也接觸到不少人有這個想法：當分離度連中國藥典那除另有規(guī)定外的L5都達不到時，開始動了定分離度1?0、1.2的心思。但往往只是大筆一揮而已！比如，方法開發(fā)及方法驗證時實際分離度為1.4,為了日后方法系統適用性通過性的保險起見，懷著一絲的忐忑，帶著歐洲藥典的一絲安慰，標準制定時寫下了L2,大膽一點的直接來個1.0。合理嗎？有人說之所以定了1.2,是來源于耐用性驗證時在某條件下的最差分離度。暫且不去推測該耐用性試驗是如何設計的，但我相信大多數情況下對于制定1.2分離度的證明性是不夠的。當然，不僅是達不到分離度L5時的退讓，更有很多達到1.5后的前進，比如分離度應大于lO.Oo這些數值的制定不僅僅是一個耐用性的探索，更不是冒險或保守之類的估計，而是需要具體的試驗設計去驗證。方法學驗證設計（針對分離度或峰谷比制定）簡述如下（如有遺漏謬誤還請自行腦補修正,朝著目標前進）：1、擬定分析方法耐用性的關鍵參數：碳酸鏤溶液濃度、流速、柱溫、色譜柱及儀器。2、擬定關鍵耐用性參數在日常檢測中可能出現的偏離，比如碳酸鍍溶液濃度由于配制過程導致的誤差，由于儀器本身性能導致的流速及柱溫控制差異，色譜柱批次間的差異，不同儀器（型號、品牌）之間的差異。這些差異均可以根據經驗及相關的性能確認（PQ）進行預先估計，在估計的基礎上適當放寬考察。3、在上述各種擬定的偏離條件下進行分離度考察，確定最差分離度，比如說是在流速2.2ml/min時分離度為最差的l.lo4、在流速2.2ml/min,分離度為1.1的條件下，設計雜質A與雜質B的靈敏度（檢測限、定量限），線性與范圍，準確度（加標回收）試驗。此時，我們甚至可以在該條件下兼顧其他雜質的再次驗證。5、在最差分離度條件下，各項驗證均滿足擬定的驗證要求時（不一定非得完全按照中國藥典9101的要求），可以合理的制定所希望的分離度或峰谷比。此外，尚需說明一點的是，耐用性不是通過性驗證,無需擬定范圍后追求耐用性試驗的通過。耐用性的參數應在方法開發(fā)階段已完成邊界的探索，并進行了初步的驗證；在方