微生物鑒定中常用的生理生化實驗

實驗九

微生物鑒定中常用的生理生化實驗一、實驗?zāi)康?.證明不同微生物對各種有機大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2.掌握進行微生物大分子物質(zhì)水解實驗的原理和方法。3.了解IMViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道細菌鑒定中的意義和方法。二、實驗材料1.菌種枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，普通變形桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌。2.培養(yǎng)基固體淀粉培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基試管，尿素瓊脂試管，醋酸鉛培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基。3.溶液和試劑革蘭氏染色用盧戈氏碘液，甲基紅指示劑。三、實驗原理1.蛋白質(zhì)水解試驗：微生物

對大分子物質(zhì)如淀粉不能直接利用，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶，裂解大分子為較小化合物，使其能被運輸至細胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖，這過程可通過觀察細菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實。淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍色，在細菌水解淀粉的區(qū)域，用碘液測定時不再產(chǎn)生藍色，表明細菌產(chǎn)生淀粉酶。2.明膠液化試驗：明膠是由膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在25℃以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體形式存在，而在25℃以上明膠會液化。有些微生物可產(chǎn)生一種稱作明膠酶的胞外酶，水解這種蛋白質(zhì)，而使明膠液化，甚至在4℃仍能保持液化狀態(tài)。尿素是由大多數(shù)哺乳動物消化蛋白質(zhì)分泌在尿液中的廢物，尿素酶能分解尿素釋放出氨，這是一個分辨細菌很有用的診斷試驗。盡管許多微生物都可以產(chǎn)生尿素酶，但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬的細菌要慢，因此，尿素酶試驗被用來從其他非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區(qū)分這個屬的成員。尿素瓊脂含有尿素葡萄糖和酚紅，酚紅在pH6.8時為黃色，而在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生尿素酶的細菌將分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基的pH升高，在pH升至8.4時，指示劑就轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。3.尿素試驗：4.硫化氫試驗：硫化氫試驗是檢測硫化氫的產(chǎn)生，也是用于腸道細菌檢查常用生化試驗。有些細菌能分解含硫的有機物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫一遇培養(yǎng)基中鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。5.甲基紅試驗：甲基紅試驗是用來檢測葡萄糖產(chǎn)生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當細菌代謝糖產(chǎn)生酸時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色（pH6.3）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡糖產(chǎn)生有機酸，但這個試驗在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上仍然是有價值的。這兩個細菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。因此大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。6.檸檬酸鹽試驗：檸檬酸鹽試驗是用來檢測檸檬酸是否被利用。有些細菌利用檸檬酸鹽作為碳源；而另一些細菌不能利用檸檬酸鹽，如產(chǎn)氣腸桿菌。細菌在分解檸檬酸鹽及培養(yǎng)基中的磷酸銨后，產(chǎn)生堿性化合物，使培養(yǎng)基的pH升高，當加入1%溴麝香草酚藍指示劑時，培養(yǎng)基就會由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{色。溴麝香草酚藍指示范圍為：pH小于6.0時呈黃色，pH在6.5~7.0時為綠色，pH大于7.6時呈藍色。三、實驗步驟（一）、淀粉水解實驗1.將固體淀粉培養(yǎng)基熔化后冷卻至50°C左右，無菌操作制成平板。2.用記號筆在平板底部劃成4部分。3.將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線接種，在平板的反面分別在4部分寫上菌名。4.將平板倒置在37°C溫箱中