電或化學(xué)刺激室旁核對(duì)大鼠胃缺血再灌注損傷的影響

電或化學(xué)刺激室旁核對(duì)大鼠胃缺血再灌注損傷的影響

大腦室（pvn）是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能非常復(fù)雜的神經(jīng)核細(xì)胞。它不僅包括合成和分泌壓力素（avp）和喚醒素的神經(jīng)內(nèi)涵大細(xì)胞，還包括合成和分泌各種絲和質(zhì)的小細(xì)胞。合成并釋放的avp作為重要的神經(jīng)鹽酸鹽和受體激素參與心血管、疼痛和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。PVN中加壓素能神經(jīng)元發(fā)出的纖維不僅直接投射到腦垂體,而且還投射到孤束核、藍(lán)斑和中縫大核以及脊髓中間外側(cè)柱的交感低位中樞等部位,同時(shí)有資料表明,在大鼠、小鼠的PVN及孤束核(nucleustractussolitarius,NTS)分布有豐富的AVP受體。近年來,我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的PVN及其相關(guān)核團(tuán)(藍(lán)斑和中縫大核)對(duì)大鼠應(yīng)激性胃粘膜損傷影響的研究表明,它們對(duì)其具有重要的調(diào)控作用。臨床上各種原因(諸如出血性休克、消化道潰瘍出血、內(nèi)臟血管破裂等)所致的胃缺血-再灌注損傷(gastricischemia-reperfusioninjury,GI-RI),實(shí)質(zhì)上也屬機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)。PVN及加壓素是否參與對(duì)GI-RI的調(diào)控,尚未見報(bào)道。為此,本文觀察了刺激PVN及外源性AVP對(duì)大鼠GI-RI的影響,并初步分析了PVN調(diào)控的神經(jīng)機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用成年健康的Sprague-Dawley雄性大鼠(180~220g),由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2外科手術(shù)全部動(dòng)物采用戊巴比妥鈉(30mg/kg,i.p.)麻醉,術(shù)后3d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2.1體外抽吸法采用朱傳江法,沿頸中部近下顎處作縱向切口,分離組織,沿基枕骨中脊向頭端剝離,可見“T”形突起。在此上方2mm與“T”形突起的縱行延長(zhǎng)線交界處,用限鉆鉆孔。鉆通后插入吸嘴,開動(dòng)真空泵,仔細(xì)吸取垂體,術(shù)后給予地塞米松和抗菌素,自由飲用葡萄糖水;假手術(shù)組僅用限鉆鉆孔,保留垂體。實(shí)驗(yàn)后查看去垂體組蝶鞍區(qū)有無殘留垂體,若有殘留則不列入統(tǒng)計(jì)。1.2.2膈下迷宮切除參照Mordes等方法,打開腹腔后,在距賁門5mm處的食管前后壁,切斷迷走神經(jīng)前、后枝。1.2.3病理組織學(xué)檢測(cè)采用Alm等方法,將胃腸推向腹腔右上方,在腹腔動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈和腸系膜上動(dòng)脈間可見灰白色的交感神經(jīng)節(jié),用有齒眼科小鑷鈍性分離并去除之,并對(duì)切除的組織作組織學(xué)鑒定;假手術(shù)組僅開腹,爾后縫合。手術(shù)結(jié)束后,再行核團(tuán)埋藏電極、套管或損毀。1.2.4脈沖激光束電刺激pvn的方法動(dòng)物頭固定于立體定位儀上,按照Paxinos和Watson腦圖譜及我們以前的方法將外徑0.4mm、內(nèi)芯尖端裸露0.5mm的同心圓刺激電極插入右側(cè)PVN(坐標(biāo):AP1.5mm,R0.4mm,H7.7~7.8mm,門齒瓣低于耳間連線3.3mm),用502膠及自凝牙托粉固定。刺激PVN的參數(shù)為單相方波,波寬0.2ms,強(qiáng)度分別為0.2、0.4mA,頻率50Hz,持續(xù)1min。刺激脈沖由刺激器產(chǎn)生并通過隔離器恒流恒壓輸出,每間隔10min刺激一次,共5次,刺激完畢立即行胃缺血-再灌注;假電刺激組只埋藏電極,不予電刺激。電損毀NTS:仍按以上圖譜,用直徑0.3mm、尖端裸露0.3mm的絕緣不銹鋼針插入兩側(cè)NTS(坐標(biāo):AP13mm,L或R0.6~0.8mm,H7.7~7.8mm),通以陽極直流電(1mA、10s)進(jìn)行電損毀;假損毀組只插針不通電。1.2.5avp-pv受體阻斷劑deam根于GI-R前10min進(jìn)行。按上述坐標(biāo)定位,用微量注射器在2min內(nèi)將新鮮配制的3%L-谷氨酸或AVP-V1受體阻斷劑(deamino-Pen1,Val4,D-Arg8-vasopressin)0.5μl分別緩慢注入一側(cè)PVN或NTS內(nèi),留針3min;對(duì)照組以同樣方法注入等量生理鹽水。AVP為RBI公司產(chǎn)品,AVP-V1受體阻斷劑為Sigma公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)時(shí)均用生理鹽水配制,pH6~7。1.3微創(chuàng)手術(shù)大鼠血清動(dòng)脈的變化按Wada等方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前禁食24h,自由飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí),烏拉坦(1g/kg,i.p.)麻醉后,將3d前已手術(shù)的大鼠開腹,仔細(xì)分離腹腔動(dòng)脈與周圍組織后,用小動(dòng)脈夾夾閉腹腔動(dòng)脈30min后去除,恢復(fù)血流再灌注60min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取胃,于10%的福爾馬林溶液中固定30min,以備作胃粘膜損傷指數(shù)的測(cè)量。1.4大鼠損傷分?jǐn)?shù)測(cè)定將已用福爾馬林溶液固定的胃沿大彎側(cè)剪開、沖洗、展平,采用Guth等方法測(cè)量計(jì)算損傷指數(shù)(damageindex,DI)作為胃缺血-再灌注損傷的指標(biāo)。其具體做法是:以局限于胃上皮的點(diǎn)狀糜爛、潰瘍、出血灶的長(zhǎng)度累積計(jì)分:0分為正常,1分≤1mm,2分≤2mm,3分≤3mm,余類推;損傷寬度超過1mm時(shí)加倍計(jì)分。每組大鼠損傷分?jǐn)?shù)的平均值即為DI,由不參與本實(shí)驗(yàn)的人員計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)完畢,各組動(dòng)物經(jīng)電極通以陽極直流電(1mA、10s)進(jìn)行損毀標(biāo)記,取腦固定于1%的亞鐵氰化鉀福爾馬林溶液中,5~7d后作冰凍切片、染色,鑒定刺激、損毀及注射部位,定位不準(zhǔn)者棄去。1.5統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD表示,多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析法(ANOVA)。以P<0.05為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。2組織學(xué)鑒定根據(jù)Paxinos和Watson腦圖譜,對(duì)實(shí)驗(yàn)中所有核團(tuán)的刺激、損毀和注射部位進(jìn)行了組織學(xué)鑒定,其中電刺激PVN及NTS電損毀、微量注射的組織學(xué)圖片見圖1。2.1不同電刺激pvn對(duì)胃粘膜損傷的保護(hù)作用以單純GI-R作為對(duì)照組,分別用0.2和0.4mA電刺激PVN,能明顯減輕GI-RI。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,與對(duì)照組和假電刺激組相比有顯著性差異(P<0.05或0.01)。表明電刺激PVN對(duì)胃粘膜損傷具有保護(hù)作用。將神經(jīng)元胞體興奮劑L-谷氨酸(L-Glu)注入一側(cè)PVN再進(jìn)行GI-R后的胃粘膜DI(n=7)與一側(cè)PVN內(nèi)注入配藥液(生理鹽水)組(n=7)相比,差異具有顯著性(P<0.05),而與電刺激PVN組的效應(yīng)相似。表明電刺激PVN減輕大鼠GI-RI系因該核團(tuán)神經(jīng)元胞體受刺激而興奮所致(圖2)。2.2血管內(nèi)皮損傷雙側(cè)假損毀NTS+假電刺激PVN+GI-R作為對(duì)照組(n=8),假損毀NTS+0.4mA電刺激PVN+GI-R組(n=6)的胃粘膜損傷與對(duì)照組相比明顯減輕,具有顯著性差異(P<0.05);損毀雙側(cè)NTS+0.4mA電刺激PVN+GI-R組(n=6)的DI與對(duì)照組相似,而與假損毀NTS+電刺激PVN+GI-R組相比,胃粘膜損傷加重,差別具有顯著性(P<0.05)。表明損毀NTS能消除電刺激PVN對(duì)GI-RI的保護(hù)作用,提示NTS可能參與PVN對(duì)GI-RI的調(diào)控。一側(cè)NTS內(nèi)注射配藥液(生理鹽水)0.5μl+電刺激PVN+GI-R(n=7)作為對(duì)照組,NTS內(nèi)注射AVP-V1受體阻斷劑200ng(0.5μl)+電刺激PVN+GI-R組(n=6)胃粘膜損傷比對(duì)照組明顯加重,兩組之間具有顯著性差異(P<0.05)。說明NTS內(nèi)注射AVP-V1受體阻斷劑可阻斷電刺激PVN對(duì)GI-RI的保護(hù)作用,提示電刺激PVN對(duì)大鼠GI-RI的調(diào)控可能是通過NTS內(nèi)的AVP-V1受體實(shí)現(xiàn)的(圖3)。2.3腦垂體假手術(shù)+0.4ma電刺激pvn+di-ri的表達(dá)±20.69,n=7);去垂體+0.4mA電刺激PVN+GI-R組DI與對(duì)照組相比明顯減輕(DI為56.62±35.48,n=8),兩組間差異具有顯著性(P<0.01),而與腦垂體假手術(shù)+0.4mA電刺激PVN+GI-RI組(DI為58.63±19.74,n=6)相比,差別無顯著性(P>0.05),表明腦垂體似不參與電刺激PVN對(duì)GI-RI的調(diào)控作用。2.4兩組患者胃粘膜損傷比較腹部假手術(shù)+GI-R作為對(duì)照組(DI為137.14±27.63,n=7);腹部假手術(shù)+0.4mA電刺激PVN+GI-R組(n=7)與對(duì)照組相比,胃粘膜損傷明顯減輕,兩組間差別具有顯著性(P<0.01);切斷膈下迷走神經(jīng)(n=6)或去除腹腔交感神經(jīng)節(jié)(n=6)后,分別用0.4mA的電刺激PVN,其GI-R的胃粘膜DI與腹部假手術(shù)+電刺激PVN+GI-R組相比,胃粘膜DI分別減低了70.31%和57.03%,差異均有顯著性(P<0.01),表明迷走神經(jīng)、交感神經(jīng)均參與PVN對(duì)GI-RI的調(diào)控作用(圖4)。2.5avp65、400ng/0.5l+i-r組的胃粘膜diPVN內(nèi)注射生理鹽水0.5μl+GI-R作為對(duì)照組,其胃粘膜DI為143.78±64.31(n=7),PVN內(nèi)分別注射AVP75、150、300ng/0.5μl+GI-R組,其胃粘膜DI分別為95.67±79.26(n=6),71.67±39.01(n=6),33.5±12.16(n=6)。各劑量組與對(duì)照組相比均有顯著性差別(P<0.05或0.01),表明PVN內(nèi)外源性AVP對(duì)大鼠GI-RI也具有明顯的保護(hù)作用。3nts內(nèi)的pvn對(duì)di-ri表達(dá)的調(diào)控室旁核(PVN)是調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)的較高級(jí)中樞,它對(duì)生理及應(yīng)激狀態(tài)下的胃酸分泌、胃電和胃運(yùn)動(dòng)及各種原因所致的胃粘膜損傷具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。本工作觀察到,用0.2、0.4mA電刺激PVN后,能明顯減輕大鼠GI-RI;一側(cè)PVN內(nèi)注射神經(jīng)元胞體興奮劑L-谷氨酸后,對(duì)GI-RI的影響與直接電刺激PVN的效應(yīng)相似,提示電刺激PVN的作用系由該核團(tuán)神經(jīng)元興奮而發(fā)揮作用的,PVN參與了對(duì)GI-RI的調(diào)控,且具有明顯的保護(hù)作用。PVN是AVP神經(jīng)元較密集的核團(tuán)之一,電刺激PVN可引起AVP的合成和釋放增加。故似可設(shè)想,電或化學(xué)刺激PVN對(duì)大鼠GI-RI的保護(hù)作用可能與興奮了PVN中的AVP神經(jīng)元,引發(fā)其合成和釋放AVP增加,通過AVP而發(fā)揮其效應(yīng)有關(guān)。PVN中的AVP能神經(jīng)元與其他腦區(qū)有直接的纖維投射,NTS是其投射的主要部位之一,并分布有特異性的AVP-V1受體,故NTS具備了AVP在其中發(fā)揮作用的可能性。我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)損毀雙側(cè)NTS,能完全消除電刺激PVN對(duì)GI-RI的保護(hù)作用,提示NTS參與了PVN對(duì)GI-RI的調(diào)控;繼之將AVP-V1受體阻斷劑注射至NTS內(nèi),觀察到同樣能消除電刺激PVN的效應(yīng),表明AVP-V1受體阻斷劑使PVN內(nèi)AVP神經(jīng)元的軸突末梢在NTS中釋放的AVP不能發(fā)揮作用。本工作還觀察到,向一側(cè)PVN內(nèi)給予不同劑量的外源性AVP,對(duì)GI-RI同樣具有保護(hù)作用,這可能是由于注射的AVP與PVN上的相應(yīng)受體結(jié)合后,通過PVN內(nèi)神經(jīng)元的感受和傳出而發(fā)揮效應(yīng)。由此可以認(rèn)為,電或化學(xué)刺激PVN對(duì)GI-RI的調(diào)控作用可能與PVN內(nèi)的AVP能神經(jīng)元軸突末梢在NTS內(nèi)釋放的AVP有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),當(dāng)事先切斷膈下迷走神經(jīng)或去除腹腔交感神經(jīng)節(jié)后再電刺激PVN,GI-RI的程度均比單純電刺激PVN時(shí)大為減輕。這一結(jié)果與我們以前研究的PVN對(duì)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍的作用相似。另有資料報(bào)道,電刺激PVN能抑制迷走神經(jīng)背核的興奮性,使迷走神經(jīng)傳出沖動(dòng)減少,導(dǎo)致胃酸分泌減少,碳酸氫鹽分泌增加,同時(shí)能減弱交感神經(jīng)的傳出沖動(dòng),看來,這些因素均有利于增強(qiáng)對(duì)胃粘膜的保護(hù)作用。故可推想,當(dāng)切斷膈下迷走神經(jīng)后,可能消除了胃酸分泌對(duì)胃的損傷作用;當(dāng)去除腹腔交感神經(jīng)節(jié)后,可能使胃粘膜血流量得到改善,這些因素都可能有助于加強(qiáng)電刺激PVN對(duì)GI-RI的保護(hù)作用。但對(duì)這些問題尚有待進(jìn)一步證實(shí)。此外,由于PVN與腦垂體之間具有密切的結(jié)構(gòu)和機(jī)能聯(lián)系,故不能排除腦垂體在電刺激PVN對(duì)GI-RI中的作用,然而當(dāng)我們?nèi)コX垂體后,并不能阻斷或削弱電刺激PVN對(duì)GI-RI的保護(hù)作用,