gnrh和gnrhr在青山羊下丘腦內(nèi)的分布

gnrh和gnrhr在青山羊下丘腦內(nèi)的分布

促性腺激素釋放激素（gnrh）是脈沖腦癱產(chǎn)生的一種十羥神經(jīng)激素。它與前葉促性腺激素細胞中的促性腺激素釋放激素受體（gnrh）結(jié)合，促進fsh和lh的分泌，保持刺激性發(fā)育和繁殖機制。1971年首次從豬和羊下丘腦內(nèi)提純出GnRH。近年來,國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用免疫細胞化學(xué)技術(shù),就GnRH免疫陽性細胞在豬、山羊和雜交水牛等下丘腦的分布多有研究,但對生后發(fā)育階段下丘腦中GnRH及其受體免疫陽性細胞的分布和變化規(guī)律的研究迄今未見文獻報道。分布于魯西南地區(qū)的濟寧青山羊是典型的性早熟品種,母羊初情期始于2月齡,3~4月齡即性成熟。為揭示GnRH及GnRHR在生后發(fā)育階段對性發(fā)育的調(diào)控機理,筆者對濟寧青山羊下丘腦各主要核團內(nèi)GnRH及GnRHR在生后發(fā)育時期的形態(tài)學(xué)變化及分布規(guī)律進行了研究,旨在為揭示濟寧青山羊性發(fā)育、性早熟以及高繁機理提供基礎(chǔ)性資料。1材料和方法1.1青山羊及其羊肉干的細胞生物學(xué)檢測選購2~3歲、體質(zhì)量24~26kg的健康雌性濟寧青山羊40只(購自山東科龍畜牧產(chǎn)業(yè)有限公司濟寧青山羊原種場),同期發(fā)情處理并人工授精使之妊娠(精液來自2~3歲,體質(zhì)量30~32kg的濟寧青山羊公羊)。濟寧青山羊羔羊按出生(0月齡)、初情期(2月齡)、性成熟(4月齡)和性成熟后(6月齡)分為4組,每個年齡組選取體質(zhì)量相近的6只宰殺。母羊與羔羊均采用舍式飼養(yǎng)。羔羊放血致死后,立即將腦置入Bouin’s固定液。在乳頭體和視交叉之間取下丘腦,經(jīng)流水沖洗12h,梯度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟包埋,連續(xù)切片,片厚10μm,切片粘貼在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上。將切片分為3套,1套用于GnRH及GnRHR的免疫組織化學(xué)SABC法染色;1套做HE染色形態(tài)學(xué)觀察并定位核團;1套做陰性對照。核團定位參照《大鼠腦立體定位圖譜》和《Netter’sAtlasofHumanNeuroscience》。1.2血清dab試驗(1)在37℃恒溫箱內(nèi)烤干的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,室溫條件下3%H2O2孵育30min,蒸餾水洗3次。(2)胰酶(北京中杉金橋生物科技公司)按1∶5稀釋后,37℃恒溫箱內(nèi)修復(fù)10min。蒸餾水洗3次。(3)山羊血清按1∶10稀釋后,37℃恒溫箱封閉30min。(4)甩去封閉液,滴加GnRH及GnRHR一抗(1∶200,北京博奧森生物科技公司),4℃過夜。(5)復(fù)溫后,PBS洗3次,每次10min。滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200,北京博奧森生物科技公司),37℃恒溫箱內(nèi)孵育1h,PBS洗3次,每次10min。(6)加入辣根過氧化物酶-鏈霉素親和素(1∶200,北京博奧森生物科技公司),37℃恒溫箱內(nèi)孵育30min,PBS洗3次,每次10min。(7)DAB試劑盒顯色(北京中杉金橋生物科技公司)1~5min,蒸餾水洗滌終止顯色。(8)蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片。陰性對照組用正常山羊血清封閉液代替一抗,其余步驟同上。1.3顯微鏡頭檢測細胞系統(tǒng)根據(jù)下丘腦各核團在空間立體結(jié)構(gòu)上分前-中-后3部分的特點,在連續(xù)切片中依次隨機抽出10張切片(確保包含各個核團的前-中-后3部分),采用OlympusBX41(DP25)顯微攝像系統(tǒng)拍照,并用Photoshop計數(shù)軟件輔助計算每張切片各核團內(nèi)陽性細胞總數(shù)。40×物鏡下每張免疫組化染色切片中相同核團隨機選取10個不同部位拍照,用美國MediaCybernetic公司生產(chǎn)的Image-Pro-Plus圖像分析軟件(Version5.0)進行陽性細胞面積分析。1.4單因子方差分析免疫組化圖像分析所得的數(shù)據(jù)用Excel2003進行統(tǒng)計,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”表示,用SPSS17.0進行單因子方差分析(one-wayANOVA)和t檢驗。2結(jié)果2.1gnrh陽性細胞的變化下丘腦各核團內(nèi)均可見GnRH免疫陽性細胞,陽性物質(zhì)呈棕色或棕黃色,分布在胞質(zhì)內(nèi)。胞核為淺藍色,位于細胞中央或一側(cè),背景無色或淡黃色。0月齡時各核團陽性細胞多呈圓形和卵圓形;2~6月齡階段各核團陽性細胞呈不規(guī)則的圓形、梭形或三角形,陽性細胞的突起染色相對較淺。0~2月齡階段陽性細胞突起少,陽性神經(jīng)纖維稀疏(圖1和圖2);4~6月齡階段陽性細胞突起增多且明顯,陽性神經(jīng)纖維的密度增大(圖3和圖4)。陰性對照呈淡藍色。各核團GnRH陽性細胞數(shù)均隨月齡增長而增大。0~2月齡時各核團GnRH陽性細胞數(shù)增長迅速(P<0.01);2~4月齡階段除室旁核外,乳頭體核和結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)核的增大差異極顯著外(P<0.01),其余核團內(nèi)陽性細胞的大小無明顯變化(P>0.05);4~6月齡階段視上核陽性細胞顯著增大(P<0.01),其余核團陽性細胞的大小變化不大(P>0.05)(表1)。各核團GnRH陽性細胞總數(shù)隨月齡增長而增多。0月齡時各核團GnRH陽性細胞最少,2月齡時均明顯增加(P<0.01);2~4月齡階段除室旁核、腹內(nèi)側(cè)核、正中隆起、視交叉上核和視前內(nèi)側(cè)核陽性細胞的數(shù)量呈極顯著增加外(P<0.01),其余核團內(nèi)陽性細胞的數(shù)量均無顯著變化(P>0.05);4~6月齡階段除室旁核顯著增多外(P<0.01),其余核團陽性細胞數(shù)變化不大(P>0.05)(表1)。2.2不同發(fā)育時期維密度的變化下丘腦GnRHR免疫陽性細胞呈棕色,陽性物質(zhì)分布在細胞質(zhì)和細胞膜上,細胞核為淺藍色。陽性細胞突起隨月齡逐漸增加,神經(jīng)纖維密度隨月齡增長而增大(圖5-圖8)。陰性對照呈淡藍色。0月齡時GnRHR陽性細胞最少,2月齡時數(shù)量均顯著增加(P<0.01),2~4月齡階段除結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)核陽性細胞數(shù)變化不大之外(P>0.05),其余核團均明顯增多(P<0.01)。4~6月齡階段除室旁核和腹內(nèi)側(cè)核GnRHR陽性細胞極顯著增多外(P<0.01),其余核團均變化不大(P>0.05)(表1)。3gnrh陽性細胞的表達濟寧青山羊下丘腦各核團中均存在GnRH免疫陽性細胞,且主要分布于下丘腦的視前內(nèi)側(cè)區(qū)、乳頭體、視上核和視交叉上核,與青年奶山羊主要分布于視上核、下丘腦前核、室旁核和弓狀核以及發(fā)情期奶山羊則主要分布于視交叉上核、室旁核、乳頭體和下丘腦前區(qū)的結(jié)果均不一致。由此推測,山羊下丘腦不同核團內(nèi)陽性細胞的這種分布特點可能與品種或生理時期有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),濟寧青山羊下丘腦各核團中GnRH陽性細胞隨著年齡的增長而增大,其中出生到2月齡時是生長高峰期。研究表明,核周體面積大小與GnRH陽性細胞的合成能力呈正相關(guān)。由此筆者認(rèn)為,濟寧青山羊下丘腦各核團陽性細胞從出生至2月齡(初情期)時快速生長,是為初情期大量分泌GnRH做準(zhǔn)備。而初情期之后,各核團GnRH陽性細胞仍繼續(xù)生長,說明陽性細胞在機能上仍在不斷完善和加強,以維持正常的脈沖頻率,進而促進FSH和LH大量分泌。GnRH分泌量的增加是性成熟啟動的關(guān)鍵因素。出生時,GnRH陽性細胞的生長受到GABA、鴉片肽和神經(jīng)肽Y等抑制因子的抑制,初情期抑制因子解除,GnRH開始大量分泌,促使FSH和LH的分泌增加,從而啟動性成熟。濟寧青山羊下丘腦各核團GnRH陽性細胞數(shù)量隨著年齡的增長而增多,筆者推測,GnRH陽性細胞的分泌機能也是隨年齡增長而加強;由于初情期GABA、鴉片肽和神經(jīng)肽Y等抑制因子的解除,2月齡(初情期)時陽性細胞的數(shù)量極顯著高于剛出生的個體。但Urbanski等和Wray等研究認(rèn)為,倉鼠和大鼠生后發(fā)育時期GnRH免疫陽性細胞總數(shù)保持不變,與本試驗結(jié)果迥異,其原因有待進一步研究。分泌GnRH的下丘腦陽性細胞上存在著GnRH特異結(jié)合位點。對體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦神經(jīng)元研究表明,GnRH和GnRHR在分泌GnRH的下丘腦陽性細胞上共表達,并檢測到調(diào)控GnRH分泌的電信號,認(rèn)為GnRH陽性細胞自分泌機制決定GnRH脈沖釋放的頻率。濟寧青山羊GnRHR陽性細胞在下丘腦各核團廣泛分布,從形態(tài)學(xué)上證實,下丘腦GnRH陽性細胞可以通過自分泌的方式對山羊的性發(fā)育進行調(diào)節(jié)。小鼠下丘腦內(nèi)有9%非分泌GnRH的神經(jīng)元表達GnRHR-I。除弓狀核外,各月齡濟寧青山羊下丘腦核團內(nèi)GnRHR陽性細胞數(shù)量均略多于GnRH陽性細胞,由此推測,濟寧青山羊下丘腦內(nèi)GnRHR可能在非分泌GnRH的神經(jīng)元上也有表達,但仍需進一步研究印證。同列相同的小寫字母表示差異不顯著(P>0.05);不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同的大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)ValueswithsamelowercasesuperscriptmeansP>0.05;ValueswithdifferentlowercasesuperscriptsmeanP<0.05;Valueswithdiff