細(xì)胞樣品RNA的提取

天津益元利康生物科技有限公司聯(lián)系人：孫經(jīng)理聯(lián)系電話胞樣品RNA的提取簡介獲得高質(zhì)量和完整的RNA是很多分子生物學(xué)實驗中最重要的一步，當(dāng)前應(yīng)用最多的是Trizol/氯仿萃取的方法。原理1、４℃預(yù)冷離心機(jī);2、取出培養(yǎng)皿，在超凈臺中去除培養(yǎng)基，按照每1x107

細(xì)胞加入１ｍLTrizol試劑，用槍頭吹打充分裂解細(xì)胞;3、將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mL無RNA酶的EP管中，向每個EP管中加入（1/5Trizol體積的）200μL氯仿，上下翻轉(zhuǎn)充分混合后，室溫靜置10分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離;4、在４℃下12000g離心15分鐘;5、離心后，將上層水相（約1/2Trizol體積）小心轉(zhuǎn)移到一個新的EP管，加入等體積異丙醇，震蕩后室溫靜置5-10分鐘，然后12000g4℃離心15分鐘，棄上清保留沉淀;6、加入1mL75％乙醇清洗并沉淀RNA，12000g離心10分鐘;7、棄上清，并重復(fù)上述操作一次;8、棄上清，在超凈工作臺中打開EP管蓋，風(fēng)干5-10分鐘，不需完全干燥;9、視沉淀的量，加入10-30μLRNase-Free的DEPC雙蒸水中;10、待沉淀溶解后，用nanodrop測定其濃度和純度并作標(biāo)記，進(jìn)行下游實驗，多余的RNA保存于-80℃冰箱。用途RT-PCR、分子克隆、Northern-Blot、RNA體外轉(zhuǎn)錄與翻譯等。材料與儀器【材料】：細(xì)胞；Trizol試劑；氯仿；異丙醇；75％乙醇（使用RNase-Free水配制）；RNase-Free水。【物品及儀器】：1.5mlEP管（RNA-free），大，中，小號槍頭（RNA-free），移液器，渦旋振蕩器，高速冷凍離心機(jī)，超凈工作臺。步驟1、４℃預(yù)冷離心機(jī);2、取出培養(yǎng)皿，在超凈臺中去除培養(yǎng)基，按照每1x107

細(xì)胞加入１ｍLTrizol試劑，用槍頭吹打充分裂解細(xì)胞;3、將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mL無RNA酶的EP管中，向每個EP管中加入（1/5Trizol體積的）200μL氯仿，上下翻轉(zhuǎn)充分混合后，室溫靜置10分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離;4、在４℃下12000g離心15分鐘;5、離心后，將上層水相（約1/2Trizol體積）小心轉(zhuǎn)移到一個新的EP管，加入等體積異丙醇，震蕩后室溫靜置5-10分鐘，然后12000g4℃離心15分鐘，棄上清保留沉淀;6、加入1mL75％乙醇清洗并沉淀RNA，12000g離心10分鐘;7、棄上清，并重復(fù)上述操作一次;8、棄上清，在超凈工作臺中打開EP管蓋，風(fēng)干5-10分鐘，不需完全干燥;9、視沉淀的量，加入10-30μLRNase-Free的DEPC雙蒸水中;10、待沉淀溶解后，用nanodrop測定其濃度和純度并作標(biāo)記，進(jìn)行下游實驗，多余的RNA保存于-80℃冰箱。注意事項1、過程中需佩戴口罩和新手套，對臺面以及周圍環(huán)境進(jìn)行滅酶處理，盡量在超凈臺中進(jìn)行操作；2、使用無Rnase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。3、溶液配制應(yīng)使用無Rnase的水，（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度為0.1%（V/V)，放置過夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，須小心操作）。4、Trizol裂解液非常危險，因小心避免濺到身上，臺面上的Trizol要及時清理干凈。常見問題RNA得率過低：1.使用更有效的破碎/勻漿方法。如液氮搗碎、酶消化破壁、電動勻漿