運(yùn)動訓(xùn)練改善心衰大鼠室旁核-氨基丁酸b型受體介導(dǎo)的交感出入口抑制性作用機(jī)制

運(yùn)動訓(xùn)練改善心衰大鼠室旁核-氨基丁酸b型受體介導(dǎo)的交感出入口抑制性作用機(jī)制

交感神經(jīng)系統(tǒng)激活是慢性心力衰竭的重要病理特征，也是導(dǎo)致心力衰竭和心力衰竭患者死亡的重要因素。有研究報(bào)道,規(guī)律性的運(yùn)動訓(xùn)練有益于心衰患者的身體康復(fù),心衰患者經(jīng)過長期的規(guī)律性運(yùn)動訓(xùn)練,不但可以提高生活質(zhì)量而且可降低死亡率.在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)運(yùn)動訓(xùn)練可提高心衰動物動脈壓力感受性反射的敏感性,進(jìn)而降低心衰狀態(tài)下的交感興奮增強(qiáng)作用.另有研究顯示,運(yùn)動訓(xùn)練可通過增加心衰大鼠下丘腦室旁核一氧化氮合成酶的表達(dá)量,進(jìn)而改善心衰狀態(tài)下由NO所介導(dǎo)的交感神經(jīng)抑制性作用而減少心衰狀態(tài)下交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活作用.進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)室旁核內(nèi)NO對腎交感神經(jīng)放電的抑制作用是通過GABA發(fā)揮作用的.而在心衰狀態(tài)下由內(nèi)源性GABA所介導(dǎo)的對腎交感神經(jīng)的抑制作用與正常大鼠比也明顯減弱,結(jié)果提示這一功能性的改變有可能是引起心衰大鼠交感神經(jīng)系統(tǒng)激動增強(qiáng)的重要機(jī)制之一.縱觀以上研究,我們擬使用冠脈結(jié)扎法建立心衰大鼠模型,通過對心衰和假手術(shù)對照大鼠進(jìn)行長期游泳訓(xùn)練,觀察運(yùn)動訓(xùn)練改善心衰狀態(tài)下室旁核內(nèi)源性GABA所介導(dǎo)的對腎交感神經(jīng)放電的抑制性作用,并進(jìn)一步論證運(yùn)動訓(xùn)練增加心衰大鼠室旁核GABAB受體mRNA表達(dá)量可能是其中的重要分子機(jī)制.1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物及儀器Wistar大鼠,雄性,體重180～200g,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供.肝素鈉購于北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司.α-氯醛糖;CGP35348;滂胺天藍(lán)均購于Sigma-Aldrich公司.2實(shí)驗(yàn)方法2.1假手術(shù)組和心力衰竭訓(xùn)練組大鼠游泳訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)Wistar大鼠隨機(jī)分成4組,即假手術(shù)安靜組(n=8)、假手術(shù)訓(xùn)練組(n=6)、心衰安靜組(n=8)和心衰訓(xùn)練組(n=8).在乙醚麻醉下將大鼠仰位固定于手術(shù)臺,自左側(cè)3～4肋間開胸,暴露心臟,于肺動脈圓錐及左心房間找出冠脈左前降支,以0號線立即結(jié)扎,將心臟送回胸腔,并擠出胸腔內(nèi)血液和氣體,迅速關(guān)閉胸腔,開胸時(shí)間不超過30秒.假手術(shù)組僅置縫線而不結(jié)扎.術(shù)后前3天,肌注青霉素,術(shù)后第4周對假手術(shù)訓(xùn)練組和心衰訓(xùn)練組大鼠行游泳訓(xùn)練實(shí)驗(yàn).2.2運(yùn)動訓(xùn)練假手術(shù)訓(xùn)練組和心衰訓(xùn)練組大鼠被放入一個(gè)圓柱狀筒(直徑120cm,高80cm)內(nèi)進(jìn)行游泳訓(xùn)練,筒內(nèi)放一溫度計(jì)控制水溫在30～32℃.動物每天上午9:00～10:00被放入筒內(nèi),由同一個(gè)人監(jiān)控游泳,每只鼠起初游泳適應(yīng)性訓(xùn)練15分鐘/天,為保證游泳訓(xùn)練的效果,1周后訓(xùn)練時(shí)間增至60分鐘/天,連續(xù)訓(xùn)練4周.每次訓(xùn)練結(jié)束后,用電吹風(fēng)機(jī)吹干鼠毛.安靜組大鼠除不經(jīng)受訓(xùn)練外,其他處理與訓(xùn)練組大鼠相同,而游泳訓(xùn)練假手術(shù)組和游泳訓(xùn)練心衰組的運(yùn)動量保持一致.在最后一次運(yùn)動訓(xùn)練過后,20～24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行大鼠的急性實(shí)驗(yàn)部分.2.3腎神經(jīng)傳導(dǎo)檢測指標(biāo)(LVEDP)、左心室最大收縮舒張速率(dP/dt)、腎交感神經(jīng)傳出放電活動(RSNA)、血壓(ABP)和心率(HR)的記錄動物腹腔注射烏拉坦(0.75g/kg)和α-氯醛糖(70mg/kg)麻醉,如需要可靜脈補(bǔ)充α-氯醛糖(0.3g/kg)麻醉,右頸總動脈插管,通過壓力換能器連接到生理記錄儀,同步采集LVSP、LVEDP和±dp/dtmax各項(xiàng)指標(biāo),記錄完左心室舒張末期壓后,將聚乙烯導(dǎo)管退出心室,可進(jìn)一步記錄動脈血壓,記錄大鼠標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖,同步得到心率.然后將大鼠取俯臥位,經(jīng)腹膜后暴露左腎,在手術(shù)顯微鏡下剝離腎交感神經(jīng),結(jié)扎遠(yuǎn)端,將神經(jīng)中樞端置于雙極鉑絲電極上,灌入配制好的溫?zé)嵋后w石蠟,溫度為37℃,使神經(jīng)與記錄電極結(jié)合處于周圍組織絕緣并濕潤和保護(hù)神經(jīng).腎神經(jīng)傳出放電信號經(jīng)生物電放大器放大后記錄到生理記錄儀上,同時(shí)對腎神經(jīng)傳出放電信號進(jìn)行積分處理.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),鉗夾神經(jīng)中樞段,以此時(shí)積分值作為RSNA的噪聲水平.由多道生理記錄儀描記的積分值減去其噪聲水平即為RSNA的積分.2.4微量注射人工瞳體gm3-4將動物俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上,參照Paxions&Waston大鼠腦圖譜,在室旁核微量注射200nl相同體積的溶劑(Vehicle)人工腦脊液(pH=7.4),并先后微量注射200nlCGP35348(0.5、1、2nmol),從每次注射完成后開始計(jì)時(shí),連續(xù)觀察RSNA、AP和HR對微量注射藥物或人工腦脊液的反應(yīng).微注射實(shí)驗(yàn)完畢,鑒定注射部位.2.5心肌面積測量上述實(shí)驗(yàn)完成后取出心臟,-20℃保存.心肌梗死面積測定方法詳見文獻(xiàn).2.6gabab受體的rt-pcr檢測已有研究報(bào)道,室旁核內(nèi)可表達(dá)GABAB受體,而GABAB受體1a亞型是GABAB受體的主導(dǎo)優(yōu)勢亞型,故選擇該亞型,通過RT-PCR的方法來檢測其與GABAB受體功能的相關(guān)性.用于GABAB受體1a亞型mRNA表達(dá)量檢測的引物序列(見表1).GABAB受體1a亞型mRNA表達(dá)量以與內(nèi)參管家基因GAPDH(磷酸甘油醛脫氫酶)的密度的比值表示.2.7治療前后心率和血壓的變化所有數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x—±SE)(x—±SE)表示,RSNA對不同劑量藥物的反應(yīng)以在基線基礎(chǔ)上的變化百分率表示,而心率和血壓對不同劑量藥物的反應(yīng)則以變化值表示.各實(shí)驗(yàn)組之間原始數(shù)據(jù)和參數(shù)的相對改變采用二元ANOVANewmanKeuls檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較或采用Student’st檢驗(yàn).P<0.05代表具有顯著性差異.3結(jié)果3.1血壓mis和左心室心肌損傷情況對大鼠心臟標(biāo)本進(jìn)行病理分析,發(fā)現(xiàn)心衰安靜組大鼠心臟重量、體重和肺濕重與假手術(shù)安靜組相比明顯增加(P<0.05),結(jié)果提示心衰大鼠出現(xiàn)水潴留.游泳訓(xùn)練能明顯降低心衰組大鼠體重和肺濕重.與假手術(shù)對照組相比,心衰組大鼠左心室心肌梗死面積(MIS)明顯增加,心梗面積在30%～40%之間;假手術(shù)大鼠左心室心肌未見損傷.心衰組大鼠左心室最大收縮舒張速率(±dp/dt)明顯低于假手術(shù)組;而心衰組大鼠左室舒張末期壓(LVEDP)卻明顯高于假手術(shù)組;以上結(jié)果提示心衰組大鼠的心臟收縮和舒張功能減退.但是游泳訓(xùn)練并沒有明顯改變假手術(shù)組和心衰組大鼠左室舒張末期壓和左心室最大收縮舒張速率.3.2大鼠室旁核內(nèi)gabab受體1亞型mrna表達(dá)量假手術(shù)安靜組、心衰安靜組、假手術(shù)訓(xùn)練組和心衰訓(xùn)練組大鼠室旁核內(nèi)GABAB受體1a亞型mRNA表達(dá)量的光強(qiáng)度比值分別為0.90、0.51、0.95和0.81.心衰安靜組大鼠室旁核內(nèi)GABAB受體1a亞型mRNA表達(dá)量與假手術(shù)安靜組相比發(fā)生下調(diào)(P<0.05).游泳訓(xùn)練明顯增加心衰訓(xùn)練組大鼠室旁核內(nèi)GABAB受體1a亞型mRNA表達(dá)量(與心衰安靜組相比,P<0.05)(見圖1).3.3組大鼠心率,血壓提高和腎市在假手術(shù)組和心衰組大鼠室旁核內(nèi)微量注射CGP35348(0.5、1和2nmol)劑量依賴性的導(dǎo)致心率、血壓的升高和腎交感神經(jīng)放電的顯著增強(qiáng).各指標(biāo)開始反應(yīng)的時(shí)間是3～5min,峰值出現(xiàn)在微量注射后的6～8min內(nèi),心衰安靜組大鼠心率、血壓升高和腎交感神經(jīng)放電的增強(qiáng)作用發(fā)生鈍化(與假手術(shù)安靜組相比)(P<0.05).游泳訓(xùn)練明顯改善心衰訓(xùn)練組大鼠心率、血壓升高和腎交感神經(jīng)放電增強(qiáng)的鈍化作用(與心衰安靜組相比,P<0.05)(見圖2).4運(yùn)動訓(xùn)練改善心力衰竭大鼠室旁核內(nèi)gabab受體表達(dá)量的機(jī)制本研究首次發(fā)現(xiàn)心衰組大鼠室旁核內(nèi)GABAB受體mRNA表達(dá)量明顯下調(diào),這種下調(diào)作用很可能是導(dǎo)致心衰大鼠交感興奮作用增強(qiáng)的重要機(jī)制之一.同時(shí),也首次證明游泳訓(xùn)練可恢復(fù)心衰組大鼠室旁核內(nèi)GABAB受體mRNA表達(dá)量,并且當(dāng)使用GABAB受體阻斷劑CGP35348阻斷室旁核內(nèi)源性GABA作用時(shí),心衰組大鼠腎交感神經(jīng)活動、心率和動脈血壓增加的作用與假手術(shù)組大鼠相比發(fā)生明顯的鈍化.而游泳訓(xùn)練過后,這種鈍化作用趨于正常.這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示運(yùn)動訓(xùn)練心衰組大鼠的交感抑制作用的增強(qiáng)可能與室旁核內(nèi)GABAB受體的上調(diào)以及室旁核內(nèi)源性GABA抑制作用的改善有關(guān).阻斷假手術(shù)安靜組大鼠室旁核GABAB受體可增加動脈血壓和腎交感神經(jīng)放電活動,提示GABAB受體參與介導(dǎo)室旁核對心血管的緊張性調(diào)節(jié)活動.而LiDP等在正常血壓大鼠上未發(fā)現(xiàn)血壓及交感神經(jīng)活動的增強(qiáng),出現(xiàn)這一矛盾結(jié)果的原因可能是因?yàn)槲⒆⑸淙軇┑捏w積不同引起(本研究使用體積為200nl,而他們使用體積為50nl).50nl溶液可能無法干預(yù)到室旁核內(nèi)大部分神經(jīng)元,而200nl卻能影響更多的神經(jīng)元.運(yùn)動訓(xùn)練運(yùn)動訓(xùn)練上調(diào)心衰大鼠室旁核GABAB受體mRNA的表達(dá)量的確切機(jī)制仍不清楚.然而,眾所周知室旁核可接收來自心迷走傳入反射等不同的心肺感受器反射的信息.有研究顯示運(yùn)動訓(xùn)練可影響心迷走神經(jīng)活動,如增加心率、心肌收縮力、心肌的前后負(fù)荷等血流動力學(xué)參數(shù).另有研究報(bào)道,運(yùn)動訓(xùn)練可增強(qiáng)動脈壓力感受性反射對心率的調(diào)控,這一機(jī)制可能與迷走神經(jīng)的緊張性增強(qiáng)有關(guān).因此,運(yùn)動訓(xùn)練時(shí)激活心迷走神經(jīng)活動可能誘發(fā)室旁核內(nèi)GABA