生物可降解性血管內(nèi)支架的制備及其生物相容性研究

生物可降解性血管內(nèi)支架的制備及其生物相容性研究

廣泛使用金屬血管內(nèi)支架治療血管狹窄。支架的結(jié)構(gòu)在材料及其結(jié)構(gòu)上得到了很大改善。然而，隨著大量臨床實(shí)踐的發(fā)現(xiàn)，在血管內(nèi)放置金屬支架后，25%-30%的患者可能出現(xiàn)血管狹窄。其原因包括金屬支架置入血管后可成為永久性金屬異物而刺激血管壁,導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生;另外隨著時(shí)間的推移金屬材料逐漸老化,在體液中可被腐蝕并釋放出金屬離子,對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響。長久以來一直在尋求一種先進(jìn)的材料制作血管內(nèi)支架,生物可降解材料的應(yīng)用曾投入大量的研究,目前國外對(duì)生物可降解性血管內(nèi)支架(biodegradableintravascularstent,BIS)的研究已由基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)入到臨床應(yīng)用研究;近年來解放軍總醫(yī)院放射科與清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系合作,采用生物可降解材料聚左旋乳酸(poly-l-lacticacid,PLLA)制備出一種可完全降解的新型血管內(nèi)支架,并對(duì)其物理學(xué)、機(jī)械力學(xué)性能及生物相容性進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和評(píng)估,現(xiàn)予以報(bào)道。材料和方法一、bis的制備1.懸浮液的配置將分子量100000U的生物可降解高分子材料PLLA加入到有機(jī)溶劑氯仿中,充分?jǐn)嚢枞芙馀渲贸少|(zhì)量體積濃度為10%(g/ml)的懸浮溶液。將懸浮溶液澆鑄到特制的不同規(guī)格的線形模具中塑型,并置于常溫?zé)o菌箱中72h以上,使溶液的溶劑揮發(fā)和滲透后,再進(jìn)行真空干燥使聚合物凝固,形成直徑為0.1～0.6mm的纖維,即可用為制作支架的基桿。2.基桿浸涂及冷凍首先將氯仿溶解的10%(g/ml)體積濃度的PLLA溶液澆鑄成基桿的內(nèi)部分(占3/5),待液體揮發(fā)基桿內(nèi)部分成形后,再采用浸涂(dip-coating)方法,將基桿內(nèi)部分在以1,4-二氧六環(huán)為溶劑的10%(g/ml)體積濃度PLLA溶液中浸沾,形成基桿的外2/5部分;繼而將其放入-23℃的冰箱中冷凍12h,之后取出置于冷凍干燥機(jī)中凍干24h;待1,4-二氧六環(huán)晶粒升華后,于材料表面即形成多數(shù)孔隙(圖1)。3.反應(yīng)蛋白的溶解先將10g明膠蛋白置于100ml水中,加熱至60℃,然后置于攪拌器攪拌10min,使明膠蛋白完全溶解。再將支架基桿在明膠溶液中浸沾,取出后又立即置入25%戊二醛溶液中浸沾(戊二醛是交聯(lián)劑,可使明膠蛋白固化),通過真空干燥后即形成單層涂膜基桿。4.下固結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)將直徑0.1～0.6mm的基桿材料纏繞在寬為2～5mm的折曲板上,置于50℃烘干箱中熱固定成形,之后取下纏繞在直徑6～15mm的金屬圓柱體上,再次熱固定成形后取下;按照需要長度裁剪支架、作兩端粘接以及相鄰支架節(jié)段間橋形粘接,最后置于80℃烘干箱中固定成形。制備成螺旋形支架和Z形支架,基桿直徑為0.1～0.6mm,支架(擴(kuò)張后)直徑在6～15mm,長度在50～80mm(圖2,3)。二、螺旋形和z形支架性能測試選擇長度50mm、基桿直徑0.5mm、支架展開后直徑7mm的螺旋形和Z形支架進(jìn)行徑向支撐力、表面覆蓋率、軸向收縮率和支架擴(kuò)張率等測試,測試方法在此不作詳述。三、可分辨率血管內(nèi)支架的生物多樣性實(shí)驗(yàn)1.股動(dòng)脈并壓縮固定實(shí)驗(yàn)用犬11只由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供,犬的雌雄不限,體重為16～25kg(平均21kg),手術(shù)前至少觀察5d,常規(guī)喂養(yǎng)。動(dòng)物作全身麻醉,采用肌內(nèi)注射速眠新(長春農(nóng)牧大學(xué)獸醫(yī)研究所生產(chǎn))0.1ml/kg體重,根據(jù)手術(shù)持續(xù)的時(shí)間和動(dòng)物的麻醉情況適當(dāng)追加,總量不超過0.2ml/kg體重。經(jīng)右側(cè)腹股溝斜形切口逐層分離暴露股動(dòng)脈,插入5F動(dòng)脈鞘并經(jīng)動(dòng)脈鞘導(dǎo)入5F導(dǎo)管;1次性注射肝素5000IU,術(shù)中每小時(shí)追加400IU;行腹主動(dòng)脈及雙側(cè)髂動(dòng)脈造影,確定支架置入的部位、管腔的大小并選擇尺寸適宜的支架;支架置入前,將支架壓縮于1cm×4cm的球囊上并固定于9F的薄壁導(dǎo)管內(nèi)。用動(dòng)脈夾在股動(dòng)脈的近端斷流,切開股動(dòng)脈將9F帶支架的導(dǎo)管逆行插入腹主動(dòng)脈,借助球囊導(dǎo)管的金屬標(biāo)志將其置于腎動(dòng)脈開口下方的腹主動(dòng)脈內(nèi);之后導(dǎo)管回退使球囊支架暴露,將在微波爐內(nèi)加熱至沸騰的對(duì)比劑用壓力注射器以6～8atm(1atm=101.325kPa)的壓力注入擴(kuò)張球囊,持續(xù)10～20s,反復(fù)3次;同時(shí)經(jīng)球囊端孔注入常溫對(duì)比劑,以比較近端腹主動(dòng)脈的直徑和球囊的直徑,避免球囊過度擴(kuò)張損傷腹主動(dòng)脈管壁(圖4);最后抽空球囊內(nèi)對(duì)比劑使球囊回縮,退出球囊導(dǎo)管。采取同樣步驟將第2枚支架置入同側(cè)髂動(dòng)脈(圖5)。支架放置完畢后,對(duì)股動(dòng)脈切口行連續(xù)縫合。術(shù)后14d內(nèi),給予阿司匹林100mg/d喂服。支架釋放后,應(yīng)立即造影觀察血管直徑、管腔通暢情況和血管壁有無損傷;動(dòng)物處死前,再行血管造影觀察支架置入段血管改變。2.病理組織學(xué)檢測支架置入后,分別于術(shù)后即刻及術(shù)后1、2、4、8、12周對(duì)實(shí)驗(yàn)犬實(shí)施過度麻醉和靜脈氣栓法處死,取出腹主動(dòng)脈近端至雙側(cè)髂動(dòng)脈遠(yuǎn)端的血管作為標(biāo)本并以10%甲醛溶液固定(圖6),繼而將支架置入段及其鄰近1cm內(nèi)的血管取下行石蠟包埋、切片(3μm厚),行HE染色和Verhoeff-VanGieson染色,供光學(xué)顯微鏡(簡稱光鏡)觀察及組織病理形態(tài)學(xué)分析。電子顯微鏡(簡稱電鏡)觀察:(1)取下支架段1.0cm×0.5cm血管壁,用0.1M的磷酸緩沖液(pH=7.2)進(jìn)行清洗;(2)以2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定2～3h后;用0.1M的磷酸緩沖液清洗4次,每次15min;(3)以1%鋨酸緩沖液固定2h,再用0.1M的磷酸緩沖液清洗4次,每次15min;(4)以乙醇作和乙腈作梯度脫水;(5)臨界點(diǎn)干燥,離子濺射儀鍍膜;(6)應(yīng)用HITACHIS-450型掃描電鏡20kV加速電壓掃描,觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞生長情況及血管結(jié)構(gòu)。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)(型號(hào):TIPAS/88解放軍計(jì)算機(jī)研究中心設(shè)計(jì)),對(duì)支架置入后不同時(shí)期血管內(nèi)膜生長厚度進(jìn)行測量,確定其內(nèi)膜面積(μm2)。結(jié)果一、軸向收縮率比較螺旋形PLLA支架的徑向支撐力為2kPa(1kPa=7.5mmHg)略大于Z形PLLA支架(1.6kPa)。螺旋形支架的軸向收縮率<10.0%,而Z形支架的軸向收縮率<8.0%,較螺旋形支架的軸向收縮率略小。螺旋形支架的表面覆蓋率為18.0%,大于Z形支架(16.0%),螺旋形支架的擴(kuò)張率(指壓縮后支架直徑與釋放后完全展開支架直徑的比值)為6.5,與Z形支架相似(6.0),螺旋形和Z形2種支架的測試結(jié)果見表1。二、支撐釋放后動(dòng)物的皮膚變化11只實(shí)驗(yàn)犬血管內(nèi)成功置入22枚支架,X線下支架本身不顯影,皆借助釋放球囊定位標(biāo)志成功地將BIS置入到預(yù)定血管。手術(shù)過程順利,全部動(dòng)物存活;2例動(dòng)物腹股溝切口處出現(xiàn)皮膚感染,經(jīng)局部創(chuàng)口處理和肌內(nèi)注射抗生素后愈合。支架釋放后造影顯示,血管腔通暢,無管腔內(nèi)充盈缺損和血管壁損傷性改變。動(dòng)物處死后標(biāo)本顯示全部支架展開良好(圖7),1枚腹主動(dòng)脈內(nèi)支架向下移位,其余位置良好。1.炎性細(xì)胞誘導(dǎo)形成反血茶苷支架置入后1周,支架桿部可見少許纖維組織和少量血小板沉著;置入后2周,于支架桿部周圍見少量新生內(nèi)膜形成,偶見炎性細(xì)胞浸潤,多為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,未見中性粒細(xì)胞;置入后4周,支架桿部大部分被新生內(nèi)膜覆蓋(圖8);8周時(shí)支架被內(nèi)膜完全覆蓋,未見明顯的內(nèi)膜增生,管壁光整、管腔開通,炎性細(xì)胞消退(圖9);12周后獲取的血管標(biāo)本經(jīng)手壓迫觸摸,感覺支架段血管彈性顯著,仍有較強(qiáng)的支撐力。2.電鏡觀察結(jié)果置入4周后,均勻覆蓋于支架表面的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育成熟、排列規(guī)則緊密,形態(tài)與鄰近血管內(nèi)膜相似。3.圖像分析的結(jié)果系統(tǒng)測量BIS置入后不同時(shí)間點(diǎn)的血管內(nèi)膜生長情況,詳見表2和圖10。bis的生物材料BIS是近年來備受到關(guān)注的新型血管內(nèi)支架,因其具有許多金屬支架不可比擬的優(yōu)點(diǎn),國外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量研究。制備支架的生物可降解材料必須具備良好的生物相容性、足夠的力學(xué)性能、可加工性、可消毒性及生物可降解性(即在生理或體內(nèi)環(huán)境下組成材料的高分子鏈能自動(dòng)斷裂形成小分子而逐漸被機(jī)體代謝或吸收)。用于制作BIS的材料有多種,如:膠原蛋白(collagen)、聚乳酸(polylacticacid,PLA)、聚左旋乳酸(poly-l-lacticacid,PLLA)、聚原酸酯(polyorthoester,POE)、聚乙內(nèi)酯(polycaprolactone,PCL)、聚乙二醇酸(polyglycolicacid)等,但以PLLA應(yīng)用較多。PLLA是一種可完全降解的生物材料,近年來許多學(xué)者對(duì)其合成、形態(tài)學(xué)、熱性能、機(jī)械性能及其在體內(nèi)和體外的降解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究;因其具有成本低、綜合力學(xué)性能好、炎癥反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn),已被美國食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)為置入人體的生物工程材料。一、雙組分纖維及其性能聚左旋乳酸是由L型丙交酯或乳酸的聚合制得,其纖維的物理和機(jī)械性能介于聚酯和聚酰胺之間,其熔點(diǎn)大約為80℃、密度1.27g/cm3、吸濕率0.6%、折光指數(shù)1.45、結(jié)晶度約為83.5%。PLLA纖維具有較好的抗張力強(qiáng)度、柔順性、熱穩(wěn)定性和機(jī)械性能。此外,PLLA具有較高的結(jié)晶度、纖維結(jié)構(gòu)規(guī)整,還具有良好的生物相容性和生物降解性,在體內(nèi)可逐漸降解為二氧化碳和水,對(duì)人體無毒性或無積累毒性。二、古支架的基礎(chǔ)構(gòu)造作為新型的支架材料,PLLA具備一定的載荷性能,可攜帶藥物或基因,隨支架置入至病變血管壁直接高濃度釋放,使藥物的供給率或基因的轉(zhuǎn)染率明顯提高。PLLA的吸濕率雖可達(dá)到自重的0.6%,但對(duì)于成型支架所需的載荷量來說還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,為此需要對(duì)支架的基桿進(jìn)行造孔。造孔必須在基桿的表面進(jìn)行,以免影響支架的力學(xué)性能。筆者采用1,4-二氧六環(huán)為溶劑和造孔劑,材料固化后,使1,4-二氧六環(huán)升華即可形成多數(shù)三維立體孔隙。此種造孔方法較為理想,因?yàn)槿芙釶LLA的溶劑和造孔劑為同一物質(zhì),省去了此后煩瑣的加工步驟。其原理是利用溶劑的結(jié)晶產(chǎn)生的固液相分離,具體步驟為:在冷凍干燥過程中,當(dāng)溶液溫度低于溶劑的凝固點(diǎn)時(shí)溶劑開始結(jié)晶,一旦結(jié)晶產(chǎn)生即可引起固液相的分離,進(jìn)而當(dāng)溶劑形成的晶體升華后,就形成了有孔洞的泡沫;而且由于固化時(shí)的溫度梯度(從表面到中心)所致,可產(chǎn)生多數(shù)高度各向異性的孔洞結(jié)構(gòu)(支架有各種各樣的孔狀結(jié)構(gòu))?，F(xiàn)今人們已掌握控制支架孔狀結(jié)構(gòu)的技術(shù),能制備孔徑從幾微米到幾百微米、孔隙度不同的海綿狀多孔結(jié)構(gòu)的支架基桿,供載荷不同成分的需要。三、涂膜支架的制作控制支架載荷物質(zhì)的釋放,與支架基桿造孔一樣是BIS制備的一個(gè)重要課題。未經(jīng)特殊處理的支架基桿,其空隙內(nèi)載荷物質(zhì)的釋放是通過載荷物質(zhì)彌散實(shí)現(xiàn)的,而摻入于支架材料中的物質(zhì)是在支架降解過程中完成的。要達(dá)到控制載荷物質(zhì)的釋放速率,需要對(duì)支架空隙進(jìn)行特殊處理。如采用不同降解速率的材料對(duì)支架空隙進(jìn)行涂膜封閉,即可達(dá)到支架緩釋的目的;涂膜材料內(nèi)也可摻入藥物,在其降解的同時(shí)將藥物釋放。筆者設(shè)計(jì)制作的涂膜支架還可用于如下研究:支架基桿表層可以涂布防止血栓形成的PLLA薄膜,此膜降解的時(shí)間需要1周左右,可使支架裸露于血管腔期中有效地防治血栓形成;此膜降解后,支架基桿的空隙開放,釋放出抗增生類藥物將防治血管平滑肌增生。雖然通過對(duì)支架基桿的造孔和分層涂膜,達(dá)到了支架載荷物質(zhì)的緩釋效果,但是控制載荷物質(zhì)的精確釋放速率是一項(xiàng)精細(xì)的工程,涉及到涂膜材料的降解時(shí)間、支架基桿空隙的大小和排列,以及所釋放藥物的化學(xué)特性等因素,尚需深入研究。四、臂架的物理和機(jī)械特征衡量血管內(nèi)支架性能的參數(shù)很多,除了對(duì)支架材料的評(píng)價(jià)之外,對(duì)支架整體性能的測試,也是衡量支架性能的重要指標(biāo)。1.支架安裝的影響是支架對(duì)徑向外壓的抗力或支架對(duì)作用外力的應(yīng)變力,此特性決定展開的支架能否牢固貼附于血管壁。支撐力弱的支架釋放后,支架不能緊貼血管壁并給予狹窄段血管足夠的力學(xué)支撐,從而易發(fā)生移位;支撐力過強(qiáng)的支架釋放后,可造成局部血管壁的損傷并嵌入到血管壁內(nèi)引起周圍組織過度的修復(fù)反應(yīng),導(dǎo)致內(nèi)膜過度增生或局部血管的動(dòng)脈瘤。2.金屬支架直徑、支架網(wǎng)眼大小支架表面積(stentsurfacearea,SSA)和其展開面積(opensurfacearea,OSA)的理想比值不應(yīng)大于0.2。因?yàn)榻饘倩蚝辖鸨砻娑加写倌饔?因此金屬表面積越小,血栓形成的幾率越小,同樣大小的1只支架,展開充分者比展開不完全者血栓形成的幾率低。金屬支架直徑、支架網(wǎng)眼大小直接與此幾率有關(guān)。本研究制備的Z形BIS表面覆蓋率為0.16,且PLLA的血栓原性較金屬支架低,符合支架的要求。3.支架抗壓抗差為壓縮后支架直徑與釋放后完全展開支架直徑的比值,也即支架擴(kuò)張率。理想的支架擴(kuò)張率應(yīng)大于6,小于4的支架不宜使用。如1只直徑壓縮為1.25mm的支架,釋放展開后直徑應(yīng)在7.5mm以上,如在5mm以下是不能使用的,本研究制備的螺旋形BIS擴(kuò)張率為6.5、Z形BIS為6.0,較金屬支架的擴(kuò)張率略差,但可以滿足支架釋放的要求。4.支架設(shè)置的短縮支架釋放后,隨管徑擴(kuò)大的同時(shí)可出現(xiàn)非線性縮短。若術(shù)前估計(jì)不足,置入的支架過分短縮,可導(dǎo)致支架不能完全覆蓋病變,甚至損傷血管;因此,術(shù)前必須選擇長度和管徑相宜的支架,本研究制備的螺旋形BIS縱向縮短率小于10%、Z形BIS小于8%,低于一些金屬或合金支架。5.bis為催化劑的支架布置由于生物可降解材料PLLA的密度低于金屬材料,BIS不能像金屬支架那樣于X射線下清晰顯影;因此,BIS釋放時(shí)必須借助釋放器的金屬定位標(biāo)志做參照,但此法不適用于日后的復(fù)查。為此國外學(xué)者曾嘗試于BIS的兩端鍍金以增加支架的顯示率,但效果不良;目前采用的血管造影或血管內(nèi)超聲等檢查方法,有利于BIS置入血管后的復(fù)查。本研究采用100000U高分子量PLLA制成的Z形血管內(nèi)支架具有良好的柔順性和彈性,易于在血管內(nèi)釋放;置入11只犬血管內(nèi)的22枚BIS其展開和開通性均較好,機(jī)械支撐力可滿足實(shí)驗(yàn)要求,僅見1枚支架移位,(可能為所選擇支架的直徑與置入血管的管徑不匹配所致)。本實(shí)驗(yàn)研制的BIS還具有熱塑特性。當(dāng)其置入靶血管后,用壓力注射器以6～8atm的壓力擴(kuò)張球囊之際,將加熱的對(duì)比劑注入。除了擴(kuò)張支架外,還將溫度作用于支架使其熱塑型,以促進(jìn)支架恢復(fù)其原構(gòu)型,并產(chǎn)生足夠的支撐力。五、bis的應(yīng)用Stack等于1988年設(shè)計(jì)和制作了第1枚生物可降解性血管內(nèi)支架,體外實(shí)驗(yàn)可承受133kPa的壓力達(dá)1個(gè)月之久,支架于9個(gè)月內(nèi)幾乎完全降解。此后,許多學(xué)者曾應(yīng)用不同的生物可降解材料設(shè)計(jì)制作各種類型支架,對(duì)其生物相容性進(jìn)行了研究并取得良好的效果。聚乳酸是目前用于制作BIS的最常用材料,聚乳酸及其共聚物也早已在醫(yī)療界得到廣泛的應(yīng)用,主要用于外科縫線、藥物緩釋膠囊、骨骼固定修復(fù)材料及骨細(xì)胞支架等方面。早期制作的BIS置入動(dòng)物血管后,可導(dǎo)致暫時(shí)性的異物反應(yīng);之后Lincoff等發(fā)現(xiàn):低分子量PLLA置入動(dòng)物血管后可引起局部血管少量血栓、內(nèi)膜增生及局限的反應(yīng)性炎癥,而高分子量PLLA則無明顯的病理性反應(yīng)。近期Tamai等設(shè)計(jì)和制作了1種新型熱球囊擴(kuò)張式BIS,并首次將其置入人體冠狀動(dòng)脈內(nèi):19處冠狀動(dòng)脈狹窄性病變處置入25枚BIS,置入后1d、3個(gè)月及6個(gè)月血管造影和血管內(nèi)超聲評(píng)價(jià)表明,BIS于人體冠狀動(dòng)脈內(nèi)未引起明顯的內(nèi)膜增生性反應(yīng)。本研究采用自制的Z形BIS置入血管后,其病理學(xué)觀察證實(shí)此種支架具有良好的生物相容性:置入血管后新生內(nèi)膜漸次覆蓋支架表面,8周時(shí)支架被新生內(nèi)膜完全覆蓋,8周后血管內(nèi)膜增生減少,偶爾可見炎性細(xì)胞浸潤,無顯著炎性反應(yīng)。六、生物可降解性血管再狹窄BIS的降解過程受其制作材料特性的影響,聚乳酸及其共聚物降解的早期階段是