中醫(yī)證候模型的建立

中醫(yī)證候模型的建立

中醫(yī)證候的動物模型是在中醫(yī)的一般概念和辯證法效應(yīng)的指導(dǎo)下，運(yùn)用內(nèi)臟象論和中醫(yī)病因病機(jī)理論，模擬和復(fù)制人類不同的臨床綜合征。建立合理有效的中醫(yī)證候動物模型是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵,是深刻揭示中醫(yī)藥治病機(jī)制的載體。理想的動物模型應(yīng)能真正反映中醫(yī)“證”的特點(diǎn),在造模動物、因素、標(biāo)準(zhǔn)及評價方法幾個方面規(guī)范化。造模評定標(biāo)準(zhǔn)體系做到指標(biāo)化客觀化,宏觀微觀結(jié)合,有利于提高科研工作的準(zhǔn)確性。代謝組學(xué)為生物體對病理生理或基因修飾等刺激產(chǎn)生的代謝物質(zhì)動態(tài)應(yīng)答的定量測定,它將人體作為一個完整的系統(tǒng),機(jī)體的生理病理過程作為一個動態(tài)的系統(tǒng)來研究。其整體性、系統(tǒng)性、動態(tài)性、綜合性與中醫(yī)理論的“整體觀”“動態(tài)觀”“辯證觀”相吻合。因此,將代謝組學(xué)理念與方法引入中醫(yī)證候模型研究對實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有重要意義。病料結(jié)合式動物模型根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論,將導(dǎo)致“證”的致病因素作用于動物,制造具有人類證候模擬表現(xiàn)的動物模型,分為單因素造模和復(fù)合因素造模兩種?？嗪疄a下藥致脾虛,勞力過度致脾虛,“恐傷腎”等均為單因素造模。如劉汶等給予大鼠番瀉葉水浸劑灌服制造脾虛證動物模型。引起中醫(yī)證候的病因具有非特異性特征,單一因素可能無法完全符合要求。復(fù)合因素造模的方法彌補(bǔ)了其不足。宋紅等以大黃法、游泳力竭法、饑餓法多因素復(fù)合建立一種新的脾氣虛證大鼠模型,其克服了單因素造模持續(xù)時間短、自愈性強(qiáng)的缺點(diǎn)。根據(jù)西藥的副作用產(chǎn)生類似證候的臨床表現(xiàn)建立動物模型,但此類模型不完全符合中醫(yī)理論。李俊麗等將大鼠灌胃給予甲狀腺片懸液制造腎陰虛模型,出現(xiàn)大便干結(jié),飲水量及食量增多、活動頻度增加、汗多、毛無光澤、體質(zhì)量下降或增長緩慢、體溫升高、尿量減少等腎陰虛表現(xiàn)。王穆等將小鼠一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺,造成血虛證模型,觀察四物湯對環(huán)磷酰胺所致的血虛證小鼠代謝組學(xué)變化的影響。病癥結(jié)合動物模型是指通過臨床調(diào)查研究,選擇有密切聯(lián)系的疾病和證候,找出兩者在臨床上的結(jié)合點(diǎn),分別或同時復(fù)制疾病與證候動物模型。杜中平等采用腹腔注射利血平的方法制作脾虛動物模型,然后采用尾根部皮下注射Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑混合物的方法誘導(dǎo)出類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)模型,觀察脾虛證RA病證結(jié)合動物模型的發(fā)病情況,并采用酶聯(lián)免疫吸附測定法等方法對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。腎陰虛模型檢測動物的一般狀態(tài)較易觀察。根據(jù)中醫(yī)理論,觀察動物的宏觀表征。如觀察腎陽虛模型多有畏寒喜暖、大便稀溏、小便清長、卷縮拱背、精神萎頓、倦怠嗜睡、自主活動次數(shù)明顯減少等表現(xiàn)。李志強(qiáng)等制造的脾虛模型組動物在4d后開始出現(xiàn)攝食明顯減少、倦怠、懶動、畏寒、毛發(fā)疏散不潔或豎毛等現(xiàn)象,與臨床上脾虛證的癥狀較相似。學(xué)術(shù)界對評價證候模型的微觀指標(biāo)進(jìn)行不懈研究并取得一定收獲。王喜軍等在研究六味地黃丸血中移形成分對氫化可的松致大鼠腎虛動物模型的保護(hù)作用時,采用皮下注射氫化可的松注射液制造大鼠腎陰虛模型,測定其微觀指標(biāo)如下:體質(zhì)量、胸腺和脾臟重量、心率、血清超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-PX)活力,血漿黏度、血清一氧化氮(nitricoxide,NO)值、血清內(nèi)皮素(endothelin,ET)值、血清睪酮(testosterone,T)值、雌二醇/睪酮(E2/T)值、血清游離甲狀腺素(freethyroxine,FT4)、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)值。任建勛等采用半高脂高糖飼料復(fù)合睡眠剝奪建立大鼠氣虛血瘀證動物模型,測定凝血功能測定凝血酶原時間、活化部分凝血激酶時間、纖維蛋白原;血管活性分子測定血管緊張素Ⅱ、ET、血栓素B2(thromboxaneB2,TXB2)等微觀指標(biāo)。“以方測證”作為一種方法,最初主要應(yīng)用于《傷寒論》和《金匱要略》方證條文的研究,主要根據(jù)方劑藥味組成及其效用來推測其所主治對象的病機(jī)或癥狀。冉秋等將已經(jīng)采用6-羥基多巴胺損毀注射法成功制作帕金森模型的SD大鼠分別灌飼桃紅四物湯、滌痰湯和天麻鉤藤飲,45d后發(fā)現(xiàn)天麻鉤藤飲對帕金森病模型相關(guān)性和中醫(yī)證候相關(guān)性的幾個指標(biāo)改善程度上遠(yuǎn)強(qiáng)于桃紅四物湯和滌痰湯,據(jù)此認(rèn)為其中醫(yī)證候?qū)傩詫儆陉幪搫语L(fēng)證。王文萍等首先建立慢性間歇性缺氧小鼠模型,每天同時灌服生脈散水提液,發(fā)現(xiàn)生脈散對模擬氣陰兩虛證的慢性缺氧小鼠自發(fā)活動、心電圖等指標(biāo)的異常改變改善作用顯著,據(jù)此初步認(rèn)定其中醫(yī)證候?qū)傩詫儆跉怅巸商撟C。生物代謝研究目前,缺乏客觀量化指標(biāo)是中醫(yī)證候動物模型評價的最大挑戰(zhàn)。將抽象的中醫(yī)證候診斷與客觀的量化指標(biāo)相聯(lián)系,是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的必要途徑。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,在方法學(xué)上具有無創(chuàng)、在體、動態(tài)等特點(diǎn),與中醫(yī)學(xué)診治中整體動態(tài)性原則具有相似性。其研究過程包括樣品制備,代謝產(chǎn)物分離、檢測與鑒定,數(shù)據(jù)分析與模型建立3個部分,通過核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquidchromatography-massspectromery,LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)技術(shù)分析尿液、血漿或血清、唾液及細(xì)胞和組織的提取液等生物樣品,結(jié)合模式識別、專家系統(tǒng)等分析方法,尋找生物標(biāo)志物,研究相關(guān)代謝物變化涉及的代謝途徑和變化規(guī)律,以闡述生物體對外界刺激的反應(yīng)機(jī)制。代謝組學(xué)是生物體整體功能狀態(tài)的“生化表現(xiàn)”,可以用來表征中醫(yī)思想中的“諸內(nèi)”,中醫(yī)思想與代謝組學(xué)思想是“外與內(nèi)”的結(jié)合。不同分析方法對失睡眠癥潛在生物標(biāo)志物的代謝組學(xué)研究近年來,國內(nèi)已經(jīng)有許多學(xué)者將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于中醫(yī)證候動物模型研究中,通過分析生物樣品,尋找中醫(yī)證候的生物標(biāo)記物。WangX等利用UPLC/HDMS對左冠狀動脈結(jié)扎法制作的心氣虛證大鼠尿液進(jìn)行了代謝組學(xué)研究,檢測尿液代謝輪廓,經(jīng)主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)得心氣虛組與空白組有顯著差異,結(jié)合正交偏最小二乘判別分析方法(O-PLS-DA)找到17種潛在生物標(biāo)志物,根據(jù)MS/MS碎片離子圖及HDMB、MetPA等數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和代謝通路分析。這些生物標(biāo)志物與糖酵解或糖異生途徑,不飽和脂肪酸、脂肪酸的生物合成,嘌呤代謝途徑有關(guān)。給予溫心方后,其中12種標(biāo)志物回調(diào)至正常水平,證明了溫心方治療心氣虛作用。PingWang等利用UPLC/HDMS對甲狀腺素和利血平誘導(dǎo)的腎陰虛證大鼠尿液進(jìn)行了代謝組學(xué)研究,找到20個潛在生物標(biāo)志物,根據(jù)MS/MS碎片離子圖鑒定其為尿酸、氨基脂肪、氨基葡萄糖等。給予六味地黃丸后,發(fā)現(xiàn)低劑量組與空白組代謝水平最為接近,為評價中藥方劑提供新方法。XijunWang等利用UPLC/MS結(jié)合多變量分析方法對臨床中黃疸病人的尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)并鑒定44個黃疸證生物標(biāo)志物,包括β-Citryl-L-谷氨酸、二甲基鳥苷、吲哚谷氨酰胺等,同時鑒定40個陽黃亞型生物標(biāo)志物及49個陰黃亞型生物標(biāo)志物,該研究依據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)為動物模型的復(fù)制與評價提供方法。BoYang等運(yùn)用UPLC/HDMS結(jié)合模式識別方法對果蠅進(jìn)行代謝組學(xué)研究,分析鑒定20個失眠癥潛在生物標(biāo)志物,主要與氨基酸代謝和脂肪酸代謝相關(guān)聯(lián),并根據(jù)其改變揭示酸棗仁湯的作用機(jī)制。嚴(yán)蓓等運(yùn)用GCTOF/MS法對心血瘀阻證與氣陰兩虛證心肌缺血大鼠模型進(jìn)行代謝組學(xué)的表征與識別。血瘀組皮下注射鹽酸腎上腺素,冰水冷刺激致血瘀模型;氣陰兩虛組剝奪睡眠致氣血兩虛模型。對各組血漿數(shù)據(jù)用PCA和最小二乘判別式分析進(jìn)行降維,發(fā)現(xiàn)纈氨酸、2-氨基丁酸、甘氨酸等是區(qū)分兩種病證的潛在生物標(biāo)志物。為探索中醫(yī)肝郁脾虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子生物學(xué)診斷指標(biāo),ZhangA等利用UPLC/HDMS結(jié)合多變量分析與通路分析篩選與肝郁脾虛證相關(guān)的4個生物標(biāo)志物,即脯氨酰基羥脯氨酸,L-高半胱氨酸,2-辛醇肉堿和α-N-苯乙?；?谷氨酰胺,此研究同時為動物模型復(fù)制提供依據(jù)。潘秋等運(yùn)用GC-MS法對糖尿病大鼠脾氣虧虛、痰瘀互阻證的尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)第6周模型組較空白組L-抗壞血酸、D-葡萄糖酸、丙氨酸、十八烷酸和戊二酸含量增加;與第3周相比,第6周模型組尿液中以上物質(zhì)增加。根據(jù)以上幾種代謝物的組合規(guī)律及含量變化,初步闡釋糖尿病大鼠中醫(yī)證候的相關(guān)代謝物特征。羅和古等運(yùn)用1H-NMR法對肝郁脾虛大鼠模型的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析,尋找肝郁脾虛證候的潛在生物標(biāo)記物。以慢性束縛方法制作肝郁脾虛模型,對正常組、模型組7d及21d大鼠的血漿1H-NMR譜進(jìn)行PCA,發(fā)現(xiàn)醋酸、乳酸、酪氨酸等5種代謝物可作為肝郁脾虛證的生物標(biāo)志物。劉志剛等運(yùn)用HPLC-MS/MS法對肺氣虛型大鼠模型的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析。以“COPD肺氣虛證動物模型”復(fù)制法復(fù)合木瓜蛋白酶霧化吸入法復(fù)制COPD肺氣虛證模型大鼠。通過對照組與模型組血漿代謝物的檢測,發(fā)現(xiàn)代謝特征有明顯區(qū)別,經(jīng)鑒定精胺、雙氫神經(jīng)酰胺、十二烷二酰肉堿等10種變化顯著的代謝物質(zhì),作為COPD肺氣虛證潛在的疾病標(biāo)志物。中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)中醫(yī)證候動物模型的建立與評價經(jīng)歷了長時間的發(fā)展,但現(xiàn)在仍處于探索階段,并存在著許多問題和爭議。主要源于證本質(zhì)研究尚未完善,臨床診斷信息無法應(yīng)用于動物模型評價中。由于個體差異,相同的因素不一定會導(dǎo)致相同的證候;宏觀表征主觀性強(qiáng),不能作為評價的唯一指標(biāo);學(xué)術(shù)界公認(rèn)的證候客觀指標(biāo)并不多,缺乏特異性等,這些都成為阻礙中醫(yī)證候動物模型發(fā)展的因素。代謝組學(xué)是一種采用系統(tǒng)生物學(xué)思路研究代謝小分子組的高通量分析方法,通過比較不同條件下的小分子代謝譜,找到具有意義的生物標(biāo)志物,為客觀評價中醫(yī)證候模型提供了新的思路與依據(jù),為實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化起到推動作用。證本質(zhì)研究又是證型規(guī)范化的前提與基礎(chǔ),是中西醫(yī)兩種醫(yī)學(xué)體系深層次溝通的必由途徑。所以深入地探索中醫(yī)“證”的診斷或評價指標(biāo),嘗試對其進(jìn)行定性定量的表達(dá)研究,是中醫(yī)證型規(guī)范化及建立中醫(yī)療效評價指標(biāo)體系的關(guān)鍵途徑,具有實(shí)際的臨床應(yīng)用價值。筆者認(rèn)為利用代謝組學(xué)技術(shù)充分認(rèn)識中醫(yī)證候/病的生物學(xué)本質(zhì),確定證/病的生物標(biāo)記物,以證/病的生物標(biāo)記物為橋接復(fù)制與證/病關(guān)聯(lián)的動物模型。建立中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù),充分發(fā)揮代謝組學(xué)以體液中全部小分子代謝產(chǎn)物