質(zhì)粒提取與純化

分子生物學(xué)試題(質(zhì)粒提取與純化；SSCP部分)一、 填空質(zhì)粒提取中細(xì)菌的裂解可采用多種方法，包括：非離子型或離子型去圬劑，有機(jī)溶劑,堿或加熱處理。2?用于分離質(zhì)粒DNA的細(xì)菌培養(yǎng)濃度達(dá)到0.8X109細(xì)胞/ml時(shí)，即可通過離心收集菌體。收集菌體使用定角轉(zhuǎn)子，離心的速度以8000r/min為宜。3?在分離質(zhì)粒DNA的菌體培養(yǎng)過程中，加入氯霉素有兩個(gè)好處：可以擴(kuò)增質(zhì)粒DNA；抑制了菌體的數(shù)量，有利于裂解。常使用的質(zhì)粒純化方法都利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小和共價(jià)閉合環(huán)狀兩個(gè)性質(zhì)。由于不同構(gòu)型的DNA插入EB的量不同，它們?cè)诃傊悄z電泳中的遷移率也不同，超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA(SC)的泳動(dòng)速度最快，一條鏈斷裂的開環(huán)狀質(zhì)粒DNA(OC)泳動(dòng)速度最慢，二條鏈斷裂的線性DNA(L)居中，通過凝膠電泳和EB染色的方法可將不同構(gòu)型的DNA分別開來。超離心法純化質(zhì)粒DNA時(shí)，選用CsCl作介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是：CsCl與不同DNA起反應(yīng);CsCl可以自動(dòng)形成密度梯度，從而使不同分子量的DNA分子得以分開。SDS是分離DNA時(shí)常用的一種陰離子除垢劑，它有四個(gè)作用：溶解膜蛋白及脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂;溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來;對(duì)RNase、Dnase有一定的抑制作用；SDS能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合形成RfO-SO3-???R2+-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性沉淀。8?堿裂解法所用溶液I、II、III的體積比為：2:4:3質(zhì)粒提取中溶液II的主要成分為SDS和NaOH。溶液III中鉀是3mol/L，乙酸根是5mol/LLiCl可沉淀大量蛋白質(zhì)和高分子RNA。1OD260=50gg質(zhì)粒DNA/ml。在堿變形法提取質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)中，聚乙二醇用于沉淀質(zhì)粒DNA。殘留在DNA樣品中的酚可抑制酶的活性。質(zhì)粒DNA提取中酚的pH值范圍是pH7.8—pH8.0o乙醇沉淀核酸的沉淀混合液中常用的單價(jià)陽離子的類型有：乙酸銨、氯化鈉和乙酸鈉。SSCP電泳方式為非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。SSCP是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來實(shí)現(xiàn)電泳分離的。影響SSCP重復(fù)性的主要因素為電泳的電壓和溫度。SSCP中使DNA雙鏈起變性作用的試劑是：甲酰胺點(diǎn)突變對(duì)SSCP檢出率的影響不僅僅取決于該點(diǎn)在DNA鏈上的位置，更取決于該位置對(duì)維持立體構(gòu)象作用的大小。二、 選擇1?質(zhì)粒提取中溶液II的主要成分為：BSDS和EDTASDS和NaOHEDTA和NaOHSDS和冰乙酸2?分離質(zhì)粒DNA時(shí)，用蔗糖的目的是：B抑制核酸酶的活性保護(hù)DNA，防止斷裂加速蛋白質(zhì)變性有利于細(xì)胞破碎關(guān)于堿解法分離質(zhì)粒DNA，下面哪一種說法不正確？：D溶液I的作用是懸浮菌體溶液II的作用是使DNA變性溶液III的作用是使DNA復(fù)性質(zhì)粒DNA分子小，所以沒有變性，染色體變性后不能復(fù)性質(zhì)粒DNA提取中酚的pH值范圍：DpH6.5?pH7.0pH8.0?pH8.5pH6.8?pH7.0Ph7.8?pH8.0CsCl-EB密度梯度離心法純化質(zhì)粒DNA的原理是：C氯化銫可以較多地插入到線狀DNA中去B.氯化銫可以較多地插入到SCDNA中去EB可以較多地插入到線狀DNA中去EB可以較多地插入到SCDNA中去6?同一種質(zhì)粒DNA,以三種不同的形式存在，電泳時(shí)，它們的遷移速率是:BOCDNA>SCDNA>LDNASCDNA>LDNA>OCDNALDNA>OCDNA.SCDNASCDNA>OCDNA>LDNA用堿法分離質(zhì)粒DNA時(shí)，染色體DNA之所以可以被除去，是因?yàn)椋篊染色體DNA斷成了碎片染色體DNA分子量大，而不能釋放染色體變性后來不及復(fù)性染色體未同蛋白質(zhì)分開而沉淀10D26o相當(dāng)于每毫升質(zhì)粒DNA：A50》g100》g50ng100ng加入溶液III后出現(xiàn)的白色絮狀沉淀不包括：A質(zhì)粒DNA和小分子量RNA染色體DNA和高分子量RNA鉀離子和SDS蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜SSCP電泳方式為：D普通瓊脂糖凝膠電泳低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳SSCP中使DNA雙鏈起變性作用的試劑是：BA.EDTA甲酰胺溴酚蘭Tris-HCl12. SSCP分離單鏈DNA片段是依據(jù)：B單鏈DNA分子量大小單鏈DNA片段空間構(gòu)象的立體位阻大小單鏈DNA帶電量的大小單鏈DNA分子量和帶電量的大小三、 是非迄今發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒都是環(huán)狀的。（錯(cuò)）質(zhì)粒DNA提取時(shí)，溶液II需新鮮配置。（對(duì)）如果溶菌酶溶液中pH值低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。（對(duì)）堿法和煮沸法分離質(zhì)粒DNA的原理是不同的。（錯(cuò)）CsCl-EB密度梯度離心法純化SCDNA原理是根據(jù)EB可以較多地插入到SCDNA中，因而沉降速度較快。（錯(cuò)）酚法和堿法分離質(zhì)粒DNA都要用溶菌酶破壁，但堿法用的溶菌酶的濃度要高。（對(duì)）氯霉素?cái)U(kuò)增DNA時(shí)，加氯霉素的時(shí)間是重要的，因?yàn)榧拥锰?，菌?shù)不夠，加入時(shí)間過遲，菌齡過老，容易自溶。（對(duì)）堿法和煮沸法分離質(zhì)粒DNA的原理是不同的。（錯(cuò)）酚法和堿法分離質(zhì)粒DNA都要用溶菌酶破壁，但堿法用的溶菌酶的濃度要高。（對(duì)）SSCP對(duì)長(zhǎng)鏈DNA或RNA的點(diǎn)突變檢出率要比短鏈的高。（錯(cuò)）SSCP分析中非變性PAG電泳分離不能反映出分子量的大小。（對(duì)）SSCP可以檢測(cè)出所有的單點(diǎn)突變。（錯(cuò)）點(diǎn)突變對(duì)SSCP檢出率的影響取決于該點(diǎn)在DNA鏈上的位置，點(diǎn)突變?cè)贒NA鏈中部要比在近端部容易被SSCP檢測(cè)出來。（錯(cuò)）四、 簡(jiǎn)答1.簡(jiǎn)述溶液I、II、III所包含成分及生化作用原理溶液I含葡萄糖和EDTA，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受機(jī)械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用（Dnase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基），另外,EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。溶液II含NaOH和SDS,核酸在pH大于5小于9的溶液中是穩(wěn)定的，但當(dāng)pH大于12或小于3時(shí)，就會(huì)引起雙鍵之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2N，加入抽提液液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒的變性。SDS是離子型表面活性劑，它主要功能有溶解細(xì)胞膜上的脂肪與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核蛋白；SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R1-O-SO3—R2+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用Rnase去除RNA時(shí)）受到干擾。溶液III是NaAc-Hac的緩沖液（pH4.8）。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液pH調(diào)回中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3MnaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾桑瑴p少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物作用后，能形成溶解度較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。2．小量制備質(zhì)粒DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，分析可能原因及解決辦法。由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意不夠，沒有去除干凈導(dǎo)致。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)，如果總是依然存在，可用離心柱純化DNA。3．溶菌酶是破碎細(xì)菌的有效方法。但有些細(xì)菌的孢子對(duì)溶菌酶不敏感，應(yīng)該如何處理？添加DTT、"巰基乙醇，或8.0mol/L的尿素等增加敏感性。4．從核酸溶液中去除蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法及原理。方法是先用酚：氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。原理：使用兩種不同的有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)比用單一有機(jī)溶劑效果更佳。繼而用氯仿抽提可除去核酸制品中殘量酚。（此外，酚雖能有效地使蛋白質(zhì)變性，卻不能完全抑制RNA酶的活性，它還能溶解帶有長(zhǎng)poly（A）段的RNA分子。使用酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）混合液可以使這兩個(gè)問題迎刃而解，）5．在用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1-0.25M?在pH為8左右的DNA溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷排斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全。當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。LiCl在質(zhì)粒DNA提取中的作用是什么？沉淀大量蛋白質(zhì)和高分子RNA。簡(jiǎn)述PCR-SSCP基本過程。1） PCR擴(kuò)增靶DNA；2） 將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，而后快速?gòu)?fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；3） 將適量單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；4） 最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果，若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對(duì)照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷DNA片段中有堿基突變。簡(jiǎn)述RNA-SSCP的基本原理。RNA有著更多精細(xì)的二級(jí)和三級(jí)構(gòu)象，這些構(gòu)象對(duì)單個(gè)堿基的突變很敏感，從而提高了檢出率，其突變檢出率可達(dá)90%以上。另外，RNA不易結(jié)合成雙鏈，因此可以較大量的進(jìn)行電泳，有利于用溴化乙錠染色。SSCP圖譜一般是二條單鏈DNA帶，有時(shí)可能只呈現(xiàn)一條SSDNA帶或三條以上的原因是什么？