質(zhì)粒DNA的分離提取與瓊脂糖凝膠電泳

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱：質(zhì)粒DNA的分離提取與瓊脂糖

凝膠電泳

班級：生工XX

姓名：XXX學(xué)號：XXXXXXXXX質(zhì)粒DNA的分離提取與瓊脂糖凝膠電泳1引言質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)菌染色體外的一個(gè)或多個(gè)能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，分子量一般在0.2?10kb范圍內(nèi)⑴。質(zhì)粒由于其特殊的性質(zhì)，已廣泛地用作基因工程中的DNA分子無性繁殖的運(yùn)載體，同時(shí)它也是研究DNA結(jié)構(gòu)與功能的較好模型。我們將通過本次實(shí)驗(yàn)了解質(zhì)粒的特性及其在分子生物學(xué)研究中的作用，并掌握質(zhì)粒DNA分離純化的原理，學(xué)習(xí)堿裂解法分離質(zhì)粒DNA和瓊脂糖凝膠電泳分離的方法，同時(shí)熟練掌握移液器及離心機(jī)的使用。2材料和方法2.1實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒DNA分離純化原理質(zhì)粒具有復(fù)制和控制機(jī)構(gòu)，能夠在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立自主地進(jìn)行自身復(fù)制，并使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)。從細(xì)胞生存來看，沒有質(zhì)粒存在，基本上不妨礙細(xì)胞的存活，因此質(zhì)粒是寄生性的復(fù)制子。根據(jù)質(zhì)粒的這種特性，通常采用DNA體外重組技術(shù)和微生物轉(zhuǎn)化等基因工程的技術(shù)和方法，使重組到質(zhì)粒的某種基因(如干擾素基因)帶進(jìn)受體細(xì)胞(如具有一定特性的大腸桿菌細(xì)胞等)表達(dá)它的遺傳性質(zhì)，改變或修飾寄主細(xì)胞原有的代謝產(chǎn)物，或產(chǎn)生新的物質(zhì)(如干擾素)。pMD18-TVector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物(TACloning)的專用載體。這種載體是由pUC18載體改建而成，在pUC18載體的多克隆位點(diǎn)處的XbaI和SalI識別位點(diǎn)之間插入了EcoRV識別位點(diǎn)，用EcoRV進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3'端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個(gè)“A”的特性，所以使用這兩種制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率［2］。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。目前應(yīng)用于質(zhì)體DNA的純化或抽取的方法眾多，例如堿溶裂法(alkalinelysis)、熱裂解法(boilingmethod)、氯化銫(CsCl)純化法，及市售柱層析套管法等。最常用的堿裂解法具效率高、價(jià)廉、簡單易學(xué)等優(yōu)點(diǎn)。其原理是利用堿處理質(zhì)粒DNA及染色體DNA，使兩者雙股打開呈單股狀態(tài)，再加酸中和，使單股回復(fù)為雙股DNA，同時(shí)在急速中和反應(yīng)中，染色體DNA因分子過于龐大以致于堿基匆忙配對，形成雜亂無序的巨大分子，對水的相對溶解度低而易被沉淀下來。相反，質(zhì)粒DNA因分子小，兩單股DNA恢復(fù)原堿基配對快而易溶于水中，所以只要經(jīng)過離心，即可將染色體DNA與質(zhì)體DNA分離。本實(shí)驗(yàn)是以堿裂解法(alkalinelysis)的方法進(jìn)行，其原理是將大腸桿菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白質(zhì)及DNA變性，然后以酸中和。小分子質(zhì)粒DNA在中和后可恢復(fù)原分的大腸桿菌染色體DNA則無法完全復(fù)原而與SDSD-K+所含復(fù)合物一起沉淀下來，可離心去除，上清液所含質(zhì)粒則可以乙醇(ethanol)或異丙醇(isopropanol)將其沉淀下來。瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。蛋白質(zhì)和核酸會根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6?9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差10Obp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。質(zhì)粒DNA的形態(tài)不一，電泳時(shí)在凝膠中的遷移率不同。超螺旋的質(zhì)粒DNA一般遷移最快、開環(huán)（缺口）質(zhì)粒DNA遷移最慢，線化DNA位于兩者之間。本實(shí)驗(yàn)采用EB對DNA進(jìn)行染色，紫外線照射下呈綠色熒光，可清除看到質(zhì)粒DNA所在位置［3］。2.2實(shí)驗(yàn)材料2.2.1菌種所用菌種為配置好的大腸桿菌菌液。2.2.2藥品及試劑所用藥品及試劑有溶液I：25mMTris-HCl（pH8.0）,10mMEDTA（pH8.0）,50mM葡萄糖；溶液II:0.2MNaOH,1%SDS（使用前以10NNaOH與10%SDS稀釋配制）；溶液III：3M醋酸鉀溶液（KAc,pH5.2）；異丙醇（isopropanol）；酚/氯仿（1：1）溶液；RNaseA:1mg/ml；1xTAE緩沖液：40mMTris-乙酸，1mMEDTA（pH8.0）；TE緩沖液；DNAmarker：DL2000；50xTAE電泳緩沖液；瓊脂糖；熒光染料；loadingbuffer等。實(shí)驗(yàn)儀器用具用到的儀器及用具有臺式型離心機(jī)；旋渦混合器；移液槍；瓊脂糖凝膠電泳；紫外線透射儀等。實(shí)驗(yàn)方法將菌液分2次集于1.5ml離心管中，4000rpm離心1min，棄去上清液。然后加入100ul預(yù)冷的溶液I，在漩渦振蕩器上劇烈震蕩，充分懸浮菌體。接著加入200ul溶液II，輕柔顛倒幾次，將離心管放于冰上1min。加入150ul預(yù)冷的溶液III，輕柔顛倒幾次，放冰上3?5min。然后加入等體積酚/氯仿（1：1）溶液450ul，顛倒均勻。15000rpm下離心10min。離心完畢后，將上清液放入另一干凈離心管中，加入與所取上清等體積酚/氯仿（1：1）溶液，顛倒混勻。將所得上清放入另一干凈離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒均勻，-20°C放置30min。取出后于15000rpm下離心10min。取出后去上清，用200ul70%乙醇吹打懸浮沉淀，再于15000rpm下離心5min，去70%乙醇洗滌液，用槍洗凈殘留溶液，將其置于超凈工作臺內(nèi)吹干。待吹干后，加入20ulTE溶液溶解DNA。用膠帶將制膠板兩頭封嚴(yán)，然后配0.9%瓊脂糖凝膠30ml:稱取0.27g瓊脂糖加入1XTAE緩沖液30ml，用微波爐溶膠。冷卻至不燙手加熒光染料2ul混勻，倒

膠，立即插上梳子，冷卻20min,輕輕拔出梳子，立即將凝膠板放入電泳槽，倒入lxTAE電泳緩沖液，使電泳液完全沒過膠。將5ul質(zhì)粒DNA與lulloadingbuffer混勻點(diǎn)入點(diǎn)樣孔，最后點(diǎn)5ulDNAMarker。鏈接電泳槽，注意正負(fù)極，DNA從負(fù)極向正極跑，100V跑約25分鐘，然后帶手套將膠小心從膠板上拿起，放在紫外燈下照射拍照。3結(jié)果將電泳后的瓊脂糖凝膠放在紫外燈的照射下觀察結(jié)果，拍照得到DNA的電泳條帶如圖1所示，其中從右數(shù)第2個(gè)電泳條帶為自己的，第3個(gè)電泳條帶為DNAMarker。圖2為DNAMarker的電泳條帶圖示。圖2DNAMarker圖2DNAMarker瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果4討論4.1對實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的分析及其結(jié)論從圖1右二電泳結(jié)果看，可以看到有三條較為清晰的條帶。其中跑在最前方的電泳條帶代表RNA，后兩條是提取出的質(zhì)粒DNA。之所以會出現(xiàn)多條條帶，是因?yàn)樵谡麄€(gè)質(zhì)粒提取過程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因，可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，因此多數(shù)質(zhì)粒提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA、開環(huán)DNA、線形DNA，其中共價(jià)閉合環(huán)狀DNA一般遷移最快，開環(huán)質(zhì)粒DNA遷移最慢，線形DNA位于兩者之間。由后兩條帶的亮度可知，跑在前面的條帶更亮，因此此條帶可能代表了共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，后面一個(gè)條帶可能為開環(huán)DNA或線形DNA。將自己做的電泳條帶與DNAMarker相對照，可以大概判斷出提取的質(zhì)粒DNA的堿基對數(shù)目約為3kb。從整體的電泳效果來看，電泳條帶均清晰可見，亮度適宜，本次試驗(yàn)做得較為成功。4.2對實(shí)驗(yàn)分析及其結(jié)論4.2.1三種溶液的作用溶液I的作用：懸浮大腸桿菌菌體，而且加溶液I后必須要將菌體懸浮徹底，不得有塊狀或大顆粒狀呈現(xiàn)，是質(zhì)粒DNA提取的首要關(guān)鍵。且其中含有的溶酶菌可以水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的01,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。另外葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會很快沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，在溶液I中加入EDTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價(jià)金屬離子都螯合掉，從而起到抑制DNase對DNA的降解和抑制微生物生長的作用。另外也可保證溶菌酶活性。溶液II的作用：提供堿性條件，在NaOH與SDS的共同作用下是大腸桿菌瞬間裂解，并變性核DNA。當(dāng)細(xì)胞懸浮于NaOH和十二烷基酸鈉（SDS）溶液中使在高pH的作用下細(xì)胞發(fā)生裂解，此外蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生變性與細(xì)胞碎片一起沉淀下來。這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從雙層膜結(jié)構(gòu)想微囊結(jié)構(gòu)的相變化。新配制的溶液II避免作為最佳溶解細(xì)胞的試劑NaOH接觸空氣中的CO2過久而減弱了堿性。用不新鮮的0.4MNaOH,即便有SDS也無法有效溶解大腸桿菌。因此必須使用新鮮的0.4MNaOH試劑進(jìn)行配制。溶液III的作用：該溶液所含有的高濃度鉀離子與溶液體系中的十二烷基磺酸鈉發(fā)生反應(yīng)形成十二烷基磺酸鉀，從而將與之結(jié)合的絕大部分大腸桿菌蛋白質(zhì)以及很長的基因組DNA一起沉淀，與質(zhì)粒分離開來；另外溶液III所含有的醋酸是為了中和NaOH,因?yàn)殚L時(shí)間的堿性條件會打斷DNA?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100kb大小的片段，就沒有辦法再被PDS共沉淀，這樣就跟質(zhì)粒DNA共存了。而且在整個(gè)質(zhì)粒DNA的提取過程中，沉淀DNA時(shí)用無水乙醇及在高鹽、低溫條件下進(jìn)行都是為了用化學(xué)或物理手段將基因組DNA分子和蛋白質(zhì)發(fā)生變性、在體系中的溶解度降低，較充分的分離提純出實(shí)驗(yàn)所需的質(zhì)粒DNA。4.2.2酚氯仿抽提DNA體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚\氯仿始終在下層，方便水相的回收。酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)。而且含質(zhì)粒DNA的水相會部分進(jìn)入到酚中，造成損失。添加異戊醇，主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，方便了水相的回收。4.2.3要將DNA保存于TE緩沖液中的原因在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。采用Tris-HCl的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖對是Tris+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA能螯合金屬離子，抑制DNase的活性，更難穩(wěn)定DNA。4.3實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)制備質(zhì)粒過程中，所有操作必須緩和，不要?jiǎng)×艺鹗?，以避免機(jī)械剪切力對DNA的斷裂作用。同時(shí)也應(yīng)防止DNase因其DNA的降解。酚/氯仿有強(qiáng)腐蝕性，使用時(shí)要格外小心，不要弄到手上，必要時(shí)帶手套。加入乙酸鉀溶液后，可用小玻璃棒輕輕攪開團(tuán)狀沉淀物，防止質(zhì)粒DNA可能被包埋在沉淀物內(nèi)，不易釋放出來。用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比單獨(dú)作用酚或氯仿更好。為充分除去殘余的蛋白質(zhì)，可以進(jìn)行多次抽提，直至兩相間無絮狀蛋白沉淀。提取的各步操作盡量在低溫條件下進(jìn)行（冰浴上）。4.4結(jié)語和展望瓊脂糖凝膠上DNA染色是核酸分析研究中的一個(gè)重要領(lǐng)域，目前其問題主要集中在如何提高染色靈敏度，使操作簡捷，以及降低試劑毒性和費(fèi)用等方面。前人雖經(jīng)過不懈努力取得了一定