第八章 吸光光度法

第八章吸光光度法Spectrophotometry2023/9/28第一節(jié)概述一、吸光光度法基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法。吸光光度法的分類（1）根據(jù)所用儀器的不同：目視比色法、光電比色法和分光光度法。（2）根據(jù)所吸收的波長范圍不同：紫外分光光度法(波長200～400nm),可見分光光度法(400～750nm)紅外光譜法(750～2500nm)2023/9/28吸光光度法特點(diǎn)：（1）靈敏度高：10-5~10-6，10-7~10-8，10-10

mol·L-1（2）準(zhǔn)確度高：比色分析，相對誤差5~10%，分光光度法，2~5%，1~2%；（3）應(yīng)用廣泛：可測定絕大多數(shù)無機(jī)物和許多有機(jī)物；（4）操作簡便儀器設(shè)備易普及。2023/9/28二、光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，具有波粒二像性。λν=c，E=hν=hc/λ單色光：復(fù)合光：由單一波長的光組成的光由不同波長的光組成的光Planck常數(shù)：h=6.626×10-34

J×S光的波長越短（頻率越高），其能量越大。白光(太陽光)：由各種單色光組成的復(fù)合光2023/9/28三、物質(zhì)對光的選擇性吸收1、吸收光譜的產(chǎn)生：吸收光譜原子吸收光譜：原子外層電子選擇性吸收某些波長電磁波線光譜分子吸收光譜：帶光譜由價(jià)電子躍遷產(chǎn)生的光譜，也稱紫外—可見光譜電子光譜振動(dòng)—轉(zhuǎn)動(dòng)光譜由分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)能級躍遷引起的，也稱紅外光譜2023/9/28分子能量電子能振動(dòng)能轉(zhuǎn)動(dòng)能分子振動(dòng)能級：分子內(nèi)部價(jià)電子運(yùn)動(dòng)，分子內(nèi)原子振動(dòng)和分子繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)。2023/9/28分子吸收光譜產(chǎn)生：分子吸收外界能量（光、電、熱）引起分子能級躍遷，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)2023/9/28電子躍遷能級較大，能量在1~20eV，紫外可見吸收光譜在200~780nm2023/9/28物質(zhì)的顏色:

物質(zhì)的顏色由透過光決定。由于不同的物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同具有不同量子化能級，產(chǎn)生的吸收不同。其顏色和光的吸收、透過、反射有關(guān)。2023/9/28①互補(bǔ)色光：把兩種適當(dāng)顏色的光按一定的強(qiáng)度比例混合，成為白光，稱為互補(bǔ)色光。2023/9/28②無色：對光譜中各種色光透過程度相同。③有色：物質(zhì)的顏色由它透過或反射的光決定。④黑色:幾乎吸收所有的入射光。⑤白色:幾乎全部反射入射光。2023/9/28吸收曲線：測量某種物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度(即吸光度A)，以波長(λ)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得到的一條吸收光譜曲線。（1）吸收曲線用途：①進(jìn)行定性分析；②進(jìn)行定量分析；③選擇吸收波長；④判斷干擾情況。2023/9/28第二節(jié)光的吸收定律一、朗伯-比爾定律描述物質(zhì)對單色光吸收強(qiáng)弱與液層厚度和待測物濃度的關(guān)系入射光I0透射光ItT稱為透光率TransmittanceT取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%A：吸光度b：光程的長度(cm):比色皿的厚度c：溶質(zhì)的濃度K：比例常數(shù)，與物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長等有關(guān)，與濃度無關(guān)。2023/9/28c：mol/L摩爾吸光系數(shù)L·mol–1·cm-1MolarAbsorptivityc：g/L吸光系數(shù)AbsorptivityL·g–1·cm-1與a的關(guān)系：2023/9/28

的含義（１）

是吸光物質(zhì)在一定波長和溶劑中的特征常數(shù)，反映該吸光物質(zhì)的靈敏度．

值越大，表示該吸光物質(zhì)對此波長光的吸收能力越強(qiáng)，顯色反應(yīng)越靈敏，在最大吸收波長處的摩爾吸光系數(shù)常以

max表示；（２）根據(jù)朗伯－比耳定律，

＝A/bc由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，以總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，

為表觀摩爾吸收系數(shù)，

=Ma,M是摩爾質(zhì)量；2023/9/28

吸光度的加和性若溶液中含有兩種或兩種以上的吸光物質(zhì)，且各物間無相互作用，則測得的吸光度為各種吸光物質(zhì)吸光度之和。

如溶液中含有A、B兩物質(zhì)，對波長為λ的光均有吸收，則A=AA+AB2023/9/28

例題鐵（Ⅱ）濃度為5.0×10-4

g·L-1

的溶液，與1，10-鄰二氮菲反應(yīng)，生成橙紅色絡(luò)合物。該絡(luò)合物在波長508nm，比色皿厚度為2cm時(shí)，測得A=0.19。計(jì)算1，10-鄰二氮菲鐵的a及

。解：已知M(Fe)=55.852023/9/28分光光度法定量分析常要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即固定液層的厚度及入射光的波長和強(qiáng)度，測定一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以吸光度對標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作圖（一過原點(diǎn)的直線），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下測定試樣的吸光度，從工作曲線查得試樣濃度，這就是工作曲線法。但在實(shí)際工作中，特別是濃度較大時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不為直線的現(xiàn)象，這稱為偏離朗伯比爾定律。二.偏離朗伯-比爾定律的原因偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個(gè)方面：光學(xué)因素；化學(xué)因素2023/9/28二.偏離朗伯-比爾定律的原因1、光學(xué)因素：非單色光引起的偏離嚴(yán)格地說，朗伯-比爾定律只適用于單色光。設(shè)入射光由

1

和2

兩種波長組成，溶液的吸光質(zhì)點(diǎn)對兩種波長的光的吸收均遵從吸收定律對1：對2：2023/9/28

1+2

：若：或或2023/9/28非單色光引起的對吸光定律的偏離對吸收光譜而言，b和c固定，

反映了

隨波長變化的情況，單一波長，

固定；不同波長，

不同。因此，非單色光將導(dǎo)致對吸光定律的偏離。2023/9/282.化學(xué)因素：由溶液本身的化學(xué)和物理因素引起的偏離(1)由于介質(zhì)不均勻性引起的偏離當(dāng)被測試液是膠體、乳濁液或懸浮物時(shí)，將對入射光產(chǎn)生散射現(xiàn)象，導(dǎo)致吸光度增大，而引起正偏離(偏向吸光度軸)。

2023/9/28橙色(2)由于溶液中的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離如吸光物質(zhì)的離解、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等。Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO42-黃色2023/9/28第三節(jié)目視比色法及光度計(jì)的基本部件一、目視比色法用眼睛比較溶液顏色深淺以測定物質(zhì)含量的方法。測定方法：標(biāo)準(zhǔn)系列法。標(biāo)1標(biāo)2標(biāo)3標(biāo)4標(biāo)5未知2023/9/28標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品2023/9/283、優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單，操作方便，不要求嚴(yán)格遵守比爾定律。4、用途:用在要求不高的常規(guī)分析中。5、缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度不高，標(biāo)準(zhǔn)系列制作麻煩，容易受干擾。2023/9/28二、分光光度法及光度計(jì)1、分光光度法：使用分光光度計(jì)進(jìn)行測定的方法。2、與比色法比較：（1）是用儀器代替人眼進(jìn)行測量，消除了人的主觀誤差，提高了準(zhǔn)確度；（2）待測溶液中有其它有色物質(zhì)共存時(shí)，可以選擇適當(dāng)?shù)膯紊夂蛥⒈热芤簛硐蓴_，因而提高選擇性；（3）在分析大批試樣時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以簡化手續(xù)，加快分析速度。2023/9/28分光光度計(jì)Agilent6010紫外/可見分光光度計(jì)2023/9/282023/9/283、光度計(jì)組成：2023/9/283、光度計(jì)組成：光源—單色器—吸收池—檢測系統(tǒng)(1)光源：要求穩(wěn)定，強(qiáng)度高.常用6~12V鎢絲燈或鹵鎢燈，2600~2870K,發(fā)320nm~2500nm的連續(xù)光譜可見光部分用其360~800nm紫外光：氫燈，氘燈，185~350nm；2023/9/28(2)單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置，分為棱鏡和光柵兩種。光柵的分辨率比棱鏡大，可用的波長范圍也較寬。2023/9/28也稱吸收池，長方體，兩面透明，有玻璃和石英玻璃兩種，規(guī)格有0.5，1.0，2.0，5.0cm等；（3）吸收池：比色皿：玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)

2023/9/28（4）檢測器：檢測器的作用是接受從吸收池發(fā)出的透射光并轉(zhuǎn)換成電信號進(jìn)行測量。分為光電池、光電管、光電倍增管和光電二極管陣列。2023/9/28顯示裝置：檢流計(jì)，數(shù)顯，記錄儀，CRT。2023/9/28練習(xí)題1、人眼能感覺到的光稱為可見光，其波長范圍是A.400~780nmB.200~320nmC.200~780nmD.200~1000nmA2、符合比爾定律的一有色溶液，當(dāng)其濃度增大時(shí)，最大吸收波長和吸光度分別是A.不變，增加B.不變，減少C.增加，不變D.減少，不變A2023/9/283、下列表述不正確的是A.吸收光譜曲線，表明了吸光度隨波長的變化關(guān)系B.吸收光譜曲線中,最大吸收處的波長為最大吸收波長C.吸收光譜曲線，以波長為縱坐標(biāo),以吸光度為橫坐標(biāo)D.吸收光譜曲線，表明了吸光物質(zhì)的吸收特性C2023/9/284、影響有色物質(zhì)摩爾吸收系數(shù)的因素是A.吸收池厚度B.入射光波長C.有色物質(zhì)溶液的濃度D.入射光的強(qiáng)度B2023/9/285、某有色物質(zhì)溶液，遵守比爾定律，當(dāng)其濃度為c時(shí)，用1.00cm比色皿測得其透光度為T，，當(dāng)濃度減小為0.50c時(shí)，，在同樣條件下測定，其透光率應(yīng)為A.T2B.2TC.T1/2D.T/2C2023/9/286、在光度計(jì)的檢流計(jì)上刻有A和T，二者關(guān)系為7、某有色物質(zhì)溶液，遵守比爾定律，當(dāng)其濃度為c時(shí)，吸光度A=0.30，那么當(dāng)濃度為2c時(shí)，該溶液的吸光度A=0.602023/9/28第四節(jié)顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇顯色反應(yīng)：將待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻?yīng)。顯色劑：與待測組分形成有色化合物的試劑。光度分析中，對于本身無吸收的待測組分，先要通過顯色反應(yīng)將待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物，然后測定吸光度或吸收曲線。在光度分析中選擇合適的顯色反應(yīng)，并嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，是十分重要的。2023/9/28一、顯色反應(yīng)的選擇1、顯色反應(yīng)的類型配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)。2、對顯色反應(yīng)的要求：（1）選擇性好，干擾少，或干擾容易消除；（2）靈敏度足夠高:超高靈敏高靈敏中等不靈敏2023/9/28（3）有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式。對于形成不同絡(luò)合比的絡(luò)合反應(yīng)，必須注意控制實(shí)驗(yàn)條件，使形成一定組成的絡(luò)合物，以免引起誤差。（4）有色化合物的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)足夠穩(wěn)定，至少保證在測量過程中溶液的吸光度變化小。這就要求有色化合物不受外界環(huán)境條件的影響：如日光照射、空氣中的氧核CO2；此外也不受溶液中其他化學(xué)因素的影響。2023/9/28（5）有色化合物與顯色劑之間的顏色差別大。顯色劑在測定波長處無明顯吸收，試劑空白小。對比度：兩有色物質(zhì)最大吸收波長之差2023/9/28二、顯色條件的選擇1、顯色劑的用量：待測組分顯色劑有色配合物2023/9/282、溶液的酸度⑴影響顯色劑濃度和顏色；顯色劑不少是有機(jī)弱酸，因此酸度的變化，將影響顯色劑的平衡濃度，并影響顯色反應(yīng)的完全程度。⑵影響Mn+的存在狀態(tài);2023/9/28⑶影響配合物的組成2023/9/283、顯色溫度的選擇一般在室溫，有時(shí)需加熱，通過實(shí)驗(yàn)確定2023/9/284、顯色反應(yīng)時(shí)間制作吸光度-時(shí)間曲線5、溶劑：降低有色化合物離解度，增加靈敏度如在Fe(SCN)3的溶液中加入與水混溶的有機(jī)試劑（如丙酮），由于降低了Fe(SCN)3的解離度而使顏色加深，提高了測定靈敏度。2023/9/286、干擾及其消除：（1）控制溶液酸度（2）加入絡(luò)合掩蔽劑或氧化還原掩蔽劑（3）利