基因工程-6-重組DNA構(gòu)建與篩選

第二節(jié)重組DNA分子構(gòu)建

一、粘末端DNA片段的連接（一）具有相同粘末端的連接EcoRIHindIIIEcoRI載體酶切HindIIIEcoRI對(duì)基因酶切（二）具有不同粘性末端的連接用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和外源DNA進(jìn)行切割后，在它們兩端會(huì)產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端，經(jīng)DNA連接酶連接后即產(chǎn)生定向重組體。

HindIII二、平末端DNA片段的連接（一）直接用T4連接酶連接（二）同聚物加尾法優(yōu)點(diǎn)：接“尾”后的載體不能自身環(huán)化，提高了轉(zhuǎn)化效率。

缺點(diǎn)：①可能改變目的基因或載體的閱讀框，影響外源DNA表達(dá)

②外源DNA無(wú)法收回

（三）銜接物連接法銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。（四）

DNA接頭連接法

接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內(nèi)切酶的粘性末端（五）

PCR引入酶切位點(diǎn)（六）

cDNA與載體的連接1.防止載體自身環(huán)化的措施

1、堿性磷酸酶脫磷酸基法

2、雙酶切法

3、過(guò)量法：基因片段：載體（5:1or10:1)

2.影響連接的因素

1、基因片段大小小>大

2、基因與載體比例5:1-10:1

3、連接酶用量1u/ug載體DNA

4、連接溫度16℃12小時(shí)

5、ATP用量

1mM（終濃度）三、重組DNA連接注意事項(xiàng)第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌

（一）轉(zhuǎn)化

將外源DNA分子導(dǎo)入某一宿主細(xì)菌細(xì)胞的過(guò)程都叫轉(zhuǎn)化。

為了有效地使細(xì)菌吸收外源的DNA分子，我們通常要對(duì)它們進(jìn)行一些物理或化學(xué)的處理，處理后的細(xì)胞吸收外源DNA的能力大大提高，被稱為感受態(tài)細(xì)胞。1、轉(zhuǎn)化過(guò)程

E.coli：感受態(tài)細(xì)胞＋重組DNA分子加入LB擴(kuò)增

涂布選擇性平板

2、DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞過(guò)程①吸收：DNA分子吸附于受體菌表面②轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子解鏈，單鏈DNA進(jìn)入，另一條鏈降解③自穩(wěn)：進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的單鏈又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA④表達(dá)：目的基因隨載體同時(shí)被復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯3、質(zhì)粒DNA的大小及構(gòu)型對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響（1）大小＞10Kb，轉(zhuǎn)化效率很低（2）構(gòu)型超螺旋＞環(huán)形＞線狀4、感受態(tài)細(xì)胞能接受外來(lái)DNA分子的本質(zhì)：

4.1局部原生質(zhì)體化假說(shuō)細(xì)胞表面的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細(xì)胞壁或局部溶解細(xì)胞壁，使DNA分子能通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)細(xì)胞。證據(jù)有：

（1）發(fā)芽的芽孢桿菌容易轉(zhuǎn)化；

（2）大腸桿菌的原生質(zhì)體不能被噬菌體感染，卻能受噬菌體DNA轉(zhuǎn)化；

（3）適量的溶菌酶能提高轉(zhuǎn)化率。

4.2酶受體假說(shuō)感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種能接受DNA的酶位點(diǎn)，使DNA分子能進(jìn)入細(xì)胞。證據(jù)是：（1）蛋白質(zhì)合成的抑制劑如氯霉素，可以抑制轉(zhuǎn)化作用；

（2）細(xì)胞分裂過(guò)程中，一直有局部原生質(zhì)化，但感受態(tài)只在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的中早期出現(xiàn)；

（3）分離到感受態(tài)因子，能使非感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺芗?xì)胞。（二）轉(zhuǎn)染（2）λ噬菌體的體外包裝轉(zhuǎn)染(transfection)：是指感受態(tài)的受體細(xì)胞捕獲和表達(dá)以噬菌體為載體的重組DNA分子的過(guò)程。（1）轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染的區(qū)別轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：通過(guò)λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)染：λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。

（三）電激法(electroperation)

電激法是利用高壓電脈沖的作用對(duì)原生質(zhì)體或細(xì)胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法?？赡鎿舸簱舸┬】卓稍谝欢〞r(shí)間內(nèi)復(fù)原。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復(fù)，處理細(xì)胞成活率低。1.電轉(zhuǎn)化流程（1）電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備（2）電轉(zhuǎn)化操作程序電擊復(fù)蘇涂布（3）電擊杯清洗二、重組DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法

（一）載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法

1、共培養(yǎng)法(cocultivation)

（1）原生質(zhì)體共培養(yǎng)法

取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛長(zhǎng)出細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。（2）葉盤(pán)共培養(yǎng)法

優(yōu)點(diǎn)：適用性廣，對(duì)于那些能被農(nóng)桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。2、活體接種(inoculationinvivo)

（二）病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

（1）雙鏈DNA病毒轉(zhuǎn)化載體

花椰菜花葉病毒（簡(jiǎn)稱CaMV,CaullinusMozicVirus）。

（2）單鏈DNA病毒轉(zhuǎn)化載體

雙聯(lián)體病毒或?qū)\生病毒感染范圍較廣，包括單子葉和雙子葉植物，它們的傳播媒介是昆蟲(chóng)。

（4）激光微束法(lasermicrobeam)

（5）超聲波法

（6）離子束法（3）電激法(electroperation)（2）微注射法（micro-injection）（三）DNA直接導(dǎo)入法

（1）基因槍法1、物理方法

（1）基因槍法

80年代末期，由康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速?zèng)_擊細(xì)胞，把細(xì)胞擊孔，使目的基因進(jìn)入受體。

基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來(lái)經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對(duì)植物細(xì)胞的毒害也比金粉大。（2）將DNA包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動(dòng)力系統(tǒng)：火藥爆炸力電弧放電高壓氣體基因槍法的特點(diǎn)：（1）轉(zhuǎn)化效率高。（2）受體廣泛。（3）操作簡(jiǎn)單。（2）微注射法（micro-injection）

微量注射：用注射針或微針在受體細(xì)胞或組織穿刺成孔，DNA隨穿刺孔進(jìn)入細(xì)胞或隨穿刺針頭—道進(jìn)入。

顯微注射：利用顯微注射儀，通過(guò)機(jī)械方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。常用的細(xì)胞固定方法有3種：一、瓊脂糖包埋法二、多聚賴氨酸粘連法三、吸管支持法（3）花粉管道法（2）脂質(zhì)體法（三）DNA直接導(dǎo)入法

（1）PEG法1、化學(xué)方法

（3）花粉管通道法（pollen-tubepathway）

在顯花植物中利用花粉在柱頭上萌發(fā)進(jìn)入胚囊所留下的通道，將外源基因滲入到胚囊中的基因直接轉(zhuǎn)移方法。（2）DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染技術(shù)

（3）電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)

（4）脂質(zhì)體載體法（5）細(xì)胞核的顯微注射法

三、重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法

（1）磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)

（6）活體電穿孔技術(shù)

活體電穿孔法(invivoelectroporation)是將外源基因通過(guò)電場(chǎng)作用，導(dǎo)入動(dòng)物目標(biāo)組織或器官?；铙w電穿孔法的特點(diǎn)：靶器官的選擇面廣對(duì)導(dǎo)入的外源基因片段的大小沒(méi)有限制,從幾KB或十幾KB的表達(dá)載體,到100～200KB的YAC、BAC基因組,都有成功導(dǎo)入并獲得表達(dá)的報(bào)道。活體電穿孔法操作簡(jiǎn)單快速,電穿孔的時(shí)間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作。研究實(shí)例一殺蚊毒素在大腸桿菌中的異源表達(dá)Thetoxiniscomposedoftwoproteins,BinAandBinB,withapproximatemolecularweightsof42and51kDa,respectively.Thetwoproteinsrequireeachotherforfullactivity,andmaximumactivityisobtainedwhenbothcomponentsarepresentinequimolarratio.1.背景介紹2.外源基因的獲得PCR引物：BinABS51F;5’-CGA

AGC

TTGTGCGATTCAAAAGACAAT-3’BS51R;5’-CCT

CGA

GAATGAATATTTGAATTTAAAGAG-3’BinBBS42F;5’-GAA

GCT

TGAGAAATTTGGATTTTATTGATT-3’BS42R;5’-GGCGGT

CGA

CTTAGTTTTGATCATCTGTAATA-3’Therestrictionsitesaddedatthe5’endoftheseprimers(HindIIIinBS42FandBS51F,SalIinBS42R,andXhoIinBS51R)areunderlined.GenesencodingBinAandBinBwereamplifiedfromplasmidpET-42fandpET-51fFigSchematicdiagramofpGEX-BinAandpGEX-BinB.Polymerasechainreaction(PCR)productsofbinAandbinBgenesweredigestedwithHindIIIatthe5’endandmadebluntendedusingKlenowpolymerase.The3’endofbinAwasdigestedwithSalI,whereasXhoIwasusedforbinB.ThedigestedfragmentsthenwereligatedtopGEX-4T-2betweenSmaIandXhoIsites.2.重組DNA構(gòu)建3.重組子篩選與表達(dá)EscherichiacoliJM109containingpGEX-BinAorpGEXBinBwasgrowninLuria-Bertani(LB)brothcontaining100lgofampicillin/mluntilOD600reached0.4.Toinduceproductionofthetoxin,1mmol/lisopropyl-b-D-thiogalactopyranoside(IPTG)wasadded,andtheculturewasfurthergrownfor5h.Theinducedculturethenwascollectedandanalyzedbysodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis(SDS).4.表達(dá)產(chǎn)物活性測(cè)試第四節(jié)重組DNA分子的篩選外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可能的三種情況：（1）（2）（3）轉(zhuǎn)化E.coli一、重組體的篩選遺傳檢測(cè)方法抗藥性標(biāo)記插入失活β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)插入序列表型特征免疫化學(xué)方法

免疫沉淀法放射性抗體檢測(cè)核酸雜交方法轉(zhuǎn)譯篩選法（一）遺傳檢測(cè)方法

原理：

根據(jù)載體DNA分子上的篩選標(biāo)記賦予受體細(xì)胞在篩選平板

上表型的變化。如抗藥性引起生長(zhǎng)與不長(zhǎng)；顏色變化等。

方法：

①插入失活抗生素平板篩選法（pBR322系統(tǒng)）

由于外源DNA的插入引起抗藥性失活——插入失活插入失活-環(huán)絲氨酸篩選法四環(huán)素+環(huán)絲氨酸氨芐青霉素②插入不分泌奶粉平板篩選法（B.SpNC3系統(tǒng)）

由于外源基因的插入而影響蛋白酶的分泌無(wú)外源DNA插入當(dāng)插入外源DNA時(shí)當(dāng)DNA不插入時(shí)NprE表達(dá)分泌溶解酪蛋白產(chǎn)生透明圈當(dāng)DNA插入時(shí)NprE不表達(dá)不分泌不溶解酪蛋白不產(chǎn)生透明圈

③顯色平板篩選法（pUC系統(tǒng))

④插入序列表型特征(二)免疫化學(xué)篩選法

原理

以目的基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物作抗原，

以動(dòng)物制備抗體，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)而將帶有目

的基因的克隆篩選出來(lái)。

方法

①免疫沉淀法

適應(yīng)于：高表達(dá)；外分泌克隆篩選

克隆沉淀線含抗體平板②放射免疫篩選法

1.放射免疫篩選過(guò)程

A、制備抗原：培養(yǎng)菌落

（噬菌斑）

B、制備抗體：免疫動(dòng)物

C、抗原抗體反應(yīng)

D、檢測(cè)：放射自顯影

E、選出重組體2.放射免疫篩選法優(yōu)點(diǎn)：

①可以選出無(wú)表型特征的克隆

②可以選出表達(dá)融合蛋白的基因克隆

3.放射免疫篩選法缺點(diǎn)：

①必須是表達(dá)載體

②需要放射性物質(zhì)——同位素：污染昂貴

(三)核酸雜交方法探針（probe）：用來(lái)探知被測(cè)物存在的小分子DNA