食品酶學(xué)緒論

食品酶學(xué)第1章緒論主要內(nèi)容1.1酶的定義與特征1.2酶學(xué)研究簡史1.3酶的分類和命名1.4酶學(xué)對食品科學(xué)的重要性1.1酶的定義與特征1.1.1酶的定義酶是由生物活細(xì)胞所產(chǎn)生的、具有高效和專一催化功能的生物大分子。（1）高效性同一反應(yīng)，酶催化反應(yīng)的速度比一般催化劑催化的反應(yīng)速度要大107～1013倍。有極少量酶就可催化大量反應(yīng)物發(fā)生轉(zhuǎn)變。1.1.2酶的特征例如，鐵離子和過氧化氫酶都可以催化雙氧水（H202）分解成為水和氧氣。在一定條件下，1mol鐵離子可催化6×10-4mol雙氧水分解。在相同條件下，1mol過氧化氫酶卻可催化5×106mol的雙氧水分解。過氧化氫酶的催化效率達(dá)到鐵離子的1010倍。（2）酶的專一性一種酶僅能作用于一種物質(zhì)，或一類分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，促其進(jìn)行一定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生一定的反應(yīng)產(chǎn)物，這種選擇性作用稱為酶的專一性。①絕對專一性這類酶對底物的要求很嚴(yán)格，甚至有時只能催化一種底物，進(jìn)行一種化學(xué)反應(yīng)。例如：過氧化氫酶只能催化過氧化氫的分解。琥珀酸脫氫酶只能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。②

相對專一性有些酶要求底物具有一定的化學(xué)鍵，對一類底物起作用，催化一類反應(yīng)。例如：淀粉酶只能催化淀粉糖苷鍵的水解；蛋白酶只能催化蛋白質(zhì)肽鍵的水解。③

立體異構(gòu)專一性幾乎所有的酶對于立體異構(gòu)體都具有高度的專一性。即酶只能催化一種立體異構(gòu)體發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)，而對另一種立體異構(gòu)體則無作用。例如：L-氨基酸氧化酶只能作用于L-氨基酸。乳酸脫氫酶能催化L-乳酸脫氫變?yōu)楸?，對D-乳酸則無作用。（3）高度受控性無論在體內(nèi)或體外，酶的催化活力都受到多種因素的調(diào)節(jié)和控制。如基因表達(dá)、輔助因子、存在狀態(tài)、反饋抑制、底物水平、激素水平、激活劑、抑制劑、溫度、pH、酶原激活等。（4）易變性大多數(shù)酶是由生物活細(xì)胞產(chǎn)生的有催化能力的蛋白質(zhì)，只要不是處于變性狀態(tài)，無論是在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外都可發(fā)揮催化作用。紫外線、熱、表面活性劑、重金屬鹽以及酸堿變性劑等能使蛋白質(zhì)變性的因素，往往也能使酶失效。酶本身能被水解蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解酶分解而喪失活性。（5）代謝相關(guān)性生物體內(nèi)幾乎所有的新陳代謝反應(yīng)都需要酶的參與，對酶的任何改變都會影響甚至改變該酶參與的生物代謝過程。1.1.3食品酶學(xué)的定義酶學(xué)是研究酶的性質(zhì)、酶的作用規(guī)律、酶的結(jié)構(gòu)和作用原理、酶的生物學(xué)功能及酶的應(yīng)用的一門科學(xué)。食品酶學(xué)是酶學(xué)的基本理論在食品科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)用的科學(xué)，是酶學(xué)的重要分支學(xué)科。主要研究食品原理、食品產(chǎn)品中酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、作用規(guī)律以及對食品儲藏、加工和食用品質(zhì)的影響，食品級酶的生產(chǎn)及其在食品儲藏、加工等環(huán)節(jié)的應(yīng)用理論與技術(shù)。1.2酶學(xué)研究簡史酶學(xué)重要性化學(xué)醫(yī)學(xué)生物工程生理學(xué)微生物學(xué)生物化學(xué)酶輕工、化工食品、醫(yī)藥能源、環(huán)保1.2.1人類利用酶的催化作用的歷史悠長而久遠(yuǎn)⑴遠(yuǎn)在進(jìn)入游牧生活時期，人類已開始利用動物的胃液（含凝乳酶）來凝固牛乳，制造干酪。⑵中國早在4000年前的夏禹時代就已掌握了用麴和蘗釀酒的技術(shù)?！稌?jīng)》中有“若作酒醴，爾維麴蘗”的記載。⑶在周朝（3000多年前），中國人民就會利用麥曲將淀粉降解為麥芽糖制造飴糖。(4)約2500年前的春秋戰(zhàn)國時期，人們已懂得利用酒曲來治療腸胃病，用雞內(nèi)金（雞胃膜）治療消化不良。⑸人們還利用糞便使獸皮脫毛，制作皮革；用胰臟軟化皮革，這些都屬于酶的作用。1.2.2酶的發(fā)現(xiàn)（1）1833年法國化學(xué)家Payen和Persoz從麥芽汁提取物中首次發(fā)現(xiàn)了淀粉酶。（2）到19世紀(jì)中期，科學(xué)家們已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了胃蛋白酶、多酚氧化酶、過氧化物酶和轉(zhuǎn)化酶等。

巴斯德主張：發(fā)酵和活細(xì)胞有關(guān)，酒精發(fā)酵是酵母細(xì)胞生活的結(jié)果。巴斯德（1822-1895）微生物學(xué)的奠基人提出分子不對稱性理論，開創(chuàng)了立體化學(xué)研究的途徑。創(chuàng)立了發(fā)酵的生物學(xué)理論，低溫消毒技術(shù)（巴氏殺菌）免疫學(xué)--預(yù)防接種，研制出狂犬疫苗李比希認(rèn)為：發(fā)酵及其他類似過程，是由于化學(xué)物質(zhì)的作用，純粹是化學(xué)過程。李比希(1803—1873)德國化學(xué)家化學(xué)教育改革家有機(jī)化學(xué)創(chuàng)始人農(nóng)業(yè)化學(xué)之父（3）關(guān)于發(fā)酵本質(zhì)的長期論戰(zhàn)從1901年到1910年最早的十次諾貝爾化學(xué)獎獲得者中，李比希的學(xué)生就有七位。（4）1897年，畢希納兩兄弟(EduardBuchner&HansBuchner)成功的從酵母細(xì)胞分離出具有發(fā)酵作用的物質(zhì)，能使糖發(fā)酵。這說明巴斯德和李比希的兩種觀點實質(zhì)上是一致的。生物化學(xué)就是在解決發(fā)酵本質(zhì)的著名論戰(zhàn)中產(chǎn)生的。HansBuchner（1850-1902）德國細(xì)菌學(xué)家EduardBuchner(1860-1917)1907年諾貝爾化學(xué)獎Enzyme的詞源1878年，德國科學(xué)家Kuhne首先提出用以表示未統(tǒng)一名稱的已知的各種酵素——enzyme。Enzyme本身的意思是“在酵母中”，起源于希臘語，其中en表示“在之內(nèi)"，zyme表示酵母。1.2.3酶催化的專一性

1894年，F(xiàn)ischer提出了“鎖和鑰匙”模型，成功解釋了酶的催化反應(yīng)機(jī)制。1959年，Koshland提出的“誘導(dǎo)契合”理論，以解釋酶的催化理論和專一性，同時也搞清了某些酶的催化活性與生理條件變化有關(guān)。1902年，Henri提出了酶與底物作用的中間復(fù)合物學(xué)說。1913年，Michaelis和Menten提出中間產(chǎn)物學(xué)說，推導(dǎo)出酶促反應(yīng)動力學(xué)方程，即著名的米氏方程：

V=Vmax[S]/Km+[S]1.2.4酶學(xué)的理論研究1926年，美國人Sumner首先從刀豆中獲得了不負(fù)載任何其他催化劑的脲酶結(jié)晶，證明脲酶具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。1930年至1936年間，制取了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶結(jié)晶。從此確立了酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的觀點，為酶的理化特性研究奠定了基礎(chǔ)。1960年，操縱子學(xué)說的提出闡明了酶生物合成的基本調(diào)節(jié)機(jī)制。1965年，Philips首次用X射線晶體衍射技術(shù)闡明了雞蛋清溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)，為以后酶結(jié)構(gòu)、功能以及催化機(jī)制的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。20世紀(jì)80年代，Cech和Altman分別發(fā)現(xiàn)了具有催化功能的RNA-核酶，這一發(fā)現(xiàn)打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念，開辟了酶學(xué)研究的新領(lǐng)域。1.2.5酶的固定化1953年，德國科學(xué)家Grubhofer和Schleith首先將聚氮基苯乙烯樹脂重氮化，將淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶結(jié)合在樹脂上，制成固定化酶，有效地進(jìn)行了酶的固定化研究。1969年日本的千畑一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。美國在20世紀(jì)70年代初開始采用固定化酶技術(shù)，使玉米淀粉經(jīng)酶法液化、糖化和異構(gòu)化后，成功地工業(yè)化生產(chǎn)第一代、第二代和第三代高果糖漿，代替蔗糖作為可口可樂和百事可樂等飲料食品的甜味劑，提高了飲料質(zhì)量，是一項非常成功的技術(shù)創(chuàng)新。1971年，出現(xiàn)了固定化菌體技術(shù)，70年代后期人們開始運用固定化細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)胞外酶。80年代中期，固定化原生質(zhì)體技術(shù)則被用于生產(chǎn)胞內(nèi)酶，以去除細(xì)胞壁擴(kuò)散的障礙。酶固定化技術(shù)的發(fā)展也引起了食品、發(fā)酵工業(yè)一場大變革。目前為止，已發(fā)現(xiàn)自然界存在的酶有3000多種，但真正形成工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的只有幾十種。1.2.6酶工程的發(fā)展

酶工程就是將酶或者微生物細(xì)胞，動植物細(xì)胞，細(xì)胞器等在一定的生物反應(yīng)裝置中，利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)并應(yīng)用于社會生活的一門科學(xué)技術(shù)。1969年，日本的千畑一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸后，學(xué)者們開始用“酶工程”這個新名詞來代表有效地利用酶的科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。而近20多年來，在酶和細(xì)胞固定化技術(shù)發(fā)展的同時，其他酶分子修飾技術(shù)也在不斷發(fā)展進(jìn)步。此外，酶的化學(xué)合成、人工模擬，以及各種酶的應(yīng)用技術(shù)研究，使酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景。1.2.7基因工程技術(shù)對酶學(xué)的影響20世紀(jì)80年代基因工程技術(shù)誕生以來，對酶學(xué)的研究與應(yīng)用技術(shù)也產(chǎn)生了深刻的影響?；蚬こ碳夹g(shù)不但促進(jìn)了基礎(chǔ)酶學(xué)的研究，如酶基因的克隆、酶催化機(jī)理的研究等，同時也促進(jìn)了酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用，奠定了現(xiàn)代食品酶學(xué)的重要發(fā)展方向。1.3酶的分類和命名1.3.1酶的命名及面臨問題1833年P(guān)ayen和Persoz發(fā)現(xiàn)麥芽提取液的酒精沉淀物中包含一種熱敏性物質(zhì)可將淀粉水解變?yōu)樘?，由于其能從不可溶的淀粉顆粒中分離出可溶性的糊精，他們將此物質(zhì)命名為“diastase”，意思是“分離”（中文現(xiàn)譯為“淀粉酶”），這樣隨意的方式成為酶命名的開端，后來命名一種酶時常加詞尾“ase”。在隨后的很長一段時間里，出現(xiàn)了各種各樣的命名方式。有根據(jù)純化后酶的顏色來命名的，如老黃酶（oldyellowenzyme）；有根據(jù)酶的來源命名的，如無花果蛋白酶（ficin），胃蛋白酶（pepsin）；有根據(jù)酶作用的底物來命名的，如果膠酶（pectase）。問題：命名混亂；一酶數(shù)名或一名數(shù)酶；不能體現(xiàn)酶所催化反應(yīng)的特性；1.3.2酶學(xué)委員會提出的命名規(guī)則酶學(xué)委員會提出以酶所催化的化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)作為酶的分類和命名規(guī)則的主要依據(jù)，每一種酶都給以三個名稱：慣用名，系統(tǒng)名和一個數(shù)字編號。慣用名不需要非常的精確，要求比較簡短，使用方便；一般根據(jù)酶所作用的底物名稱、催化的反應(yīng)性質(zhì)、酶的來源或其他特點來進(jìn)行命名。系統(tǒng)名要求能確切地表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的催化性質(zhì)；包括兩部分，底物名稱及反應(yīng)類型；若酶催化的反應(yīng)中有兩種底物起反應(yīng)，則這兩種底物均需表明，當(dāng)中用“：”隔開。若底物之一是水時，可將水略去不寫。例：多酚氧化酶其系統(tǒng)名稱為：1,2-苯二酚：氧-氧化還原酶。數(shù)字編號系統(tǒng)根據(jù)酶所催化反應(yīng)的類型將酶分為6大類，并以4個阿拉伯?dāng)?shù)字來對每一種酶進(jìn)行編號。例如乙醇脫氫酶，編號為EC1.1.1.1。EC是指酶學(xué)委員會（EnzymeCommission）。第一個數(shù)字代表酶的6個大分類，以1，2，3，4，5，6來分別代表如下6大酶類：（1）氧化還原酶（Oxidoreductases）催化氧化還原反應(yīng)；（2）轉(zhuǎn)移酶（Transferases）催化分子間基團(tuán)轉(zhuǎn)移的反應(yīng)；（3）水解酶（Hydrolases）催化水解反應(yīng)；（4）裂合酶（Lyases）催化非水解地除去底物分子中的基團(tuán)及其逆反應(yīng)；（5）異構(gòu)酶（Isomerases）催化分子的異構(gòu)反應(yīng)；（6）合成酶（synthetases）催化兩分子連接的反應(yīng)。1.3.3同工酶的命名

同工酶是指在生物體內(nèi)或組織中催化相同反應(yīng)而具有不同分子形式（包括不同的氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)等）的酶。國際生化協(xié)會同工酶分委員會建議同工酶的名稱根據(jù)他們在電泳中分離的位置確定，從電泳中向著陽極移動最遠(yuǎn)的酶開始依次編號。1.4.1酶對食品加工和保藏的重要性（1）控制食品原料中的酶活力有效改善食品原料的風(fēng)味和質(zhì)地結(jié)構(gòu)（2）利用酶的催化活性進(jìn)行食品加工及保藏1.4酶學(xué)對食品科學(xué)的重要性葡萄糖氧化酶作為除氧劑普遍應(yīng)用于食品保鮮及包裝中，延長食品保質(zhì)期。溶菌酶在食鹽、蔗糖等溶液中穩(wěn)定，耐酸耐熱性強(qiáng)，是天然安全的食品防腐劑。1.4.2酶對食品安全的重要性（1）通過基因工程手段改造部分微生物基因，改變酶蛋白的基本結(jié)構(gòu)，達(dá)到強(qiáng)化酶在某方面功能特性的做法給食品酶的應(yīng)用帶來安全隱患。（2）酶作用會使食品品質(zhì)特性發(fā)生改變，有可能會產(chǎn)生毒素和其他不利于健康的有害物質(zhì)。如果將加入食品中的酶看作為食品添加劑，那么就應(yīng)該考慮到衛(wèi)生和安全方面的問題。（3）利用酶法解毒。例如，利用乳糖酶預(yù)先處理乳制品，可以有效緩解或消除人體因消化乳糖困難而引起的胃脹氣、腹痛、嘔吐或拉肚子等癥狀。1.4.3酶對食品營養(yǎng)的重要性（1）酶作用有可能導(dǎo)致食品中營養(yǎng)組分的損失。（2）利用酶作用去除食品中的抗?fàn)I養(yǎng)素，提高食品的營養(yǎng)價值，使食品中的營養(yǎng)元素更利于人體的吸收利用。1.4.4酶對食品分析的重要性酶法分析具有準(zhǔn)確、快速、專一性和靈敏性強(qiáng)等特點，其中最大優(yōu)點就是酶的催化專一性強(qiáng)。酶法分析的樣品一般不需要進(jìn)行很復(fù)雜的預(yù)處理，尤其適合食品這一復(fù)雜體系。1.4.5酶與食品生物技術(shù)食品生物技術(shù)是生物技術(shù)的重要分支學(xué)科，主要研究基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程在食品工業(yè)上的應(yīng)用。酶工程的主要研究內(nèi)容是把游離酶固定化，或者把經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生目的酶活力高峰時的整個微生物細(xì)胞再固定化，然后直接應(yīng)用于食品生產(chǎn)過程中物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。酶不僅作為一類重要的研究對象，同時也作為重要的研究工具。課后思考1、酶的特性有哪些？2、國際酶學(xué)委員會推薦的分類和命名規(guī)則的主要依據(jù)是什么？3、酶對食品科學(xué)的重要性表現(xiàn)在哪些方面？第2章酶的生產(chǎn)與分離純化主要內(nèi)容

2.1國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀

2.2酶的發(fā)酵生產(chǎn)

2.3酶的分離純化

2.4酶分離、純化的評價

2.5酶的劑型與保存

工業(yè)酶制劑的主要來源：動物：豬胰蛋白酶、胃蛋白酶植物：木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、麥芽淀粉水解酶微生物：酶的主要來源2.1國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀

目前工業(yè)應(yīng)用的三大主要酶制劑：淀粉酶——烘焙、釀造、淀粉糖化、紡織業(yè)蛋白酶——去污劑、奶制品業(yè)、皮革業(yè)脂肪酶——去污劑、食品、精細(xì)化工2.1.2集中壟斷，市場全球化規(guī)模企業(yè)由20世紀(jì)80年代初的80多家減少至20多家，占市場90%丹麥諾和諾得公司（諾維信novozymes）→1978年進(jìn)入中國諾維信公司，占50%市場（天津）；美國杰能科公司（Genencor）→98年進(jìn)入中國，與無錫合資，控股80%（無錫），兩家公司銷售額占全球2/3；（2005年杰能科國際公司被丹尼斯克公司收購）；芬蘭科特公司和丹麥丹尼斯克公司酶制劑業(yè)務(wù)合并，Pfizer，Rhone，SKW,Biosystems，日本天野2.1.3品種、規(guī)模不斷擴(kuò)大目前30多家600多個品種，應(yīng)用于18個工業(yè)領(lǐng)域;我國2000年酶制劑產(chǎn)量為30萬噸，100家，市場份額僅占5%，以未經(jīng)除菌去渣的粗制品粉狀酶為主;國際以液體、顆粒為主;國內(nèi)糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類占97%;重要產(chǎn)品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國內(nèi)尚未投入生產(chǎn);我國有7家上市公司介入酶制劑開發(fā)生產(chǎn)。2.1.4應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大美國酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學(xué)工業(yè)。2.2酶的發(fā)酵生產(chǎn)用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞需具備的條件：酶產(chǎn)量高容易培養(yǎng)和管理產(chǎn)酶穩(wěn)定性好利于酶的分離純化安全可靠

利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點：(1)微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2)微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。(3)微生物培養(yǎng)基來源廣泛、價格便宜。(4)可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動化，經(jīng)濟(jì)效益高。(5)可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種。2.2.1產(chǎn)酶微生物

菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。目前投入工業(yè)酶發(fā)酵生產(chǎn)的菌種約有50～60種，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。2.2.2酶的發(fā)酵技術(shù)2.2.2.1培養(yǎng)基培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無機(jī)鹽、生長因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。

（1）碳源碳源是指能夠向細(xì)胞提供碳素化合物的營養(yǎng)物質(zhì)。也是提供能量的能源。碳素是構(gòu)成細(xì)胞成分的主要元素之一，也是各種酶的重要組成元素。所以，碳源是酶發(fā)酵生產(chǎn)乃至其他產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)。碳源的選擇：不同細(xì)胞對碳源的利用情況；碳源對酶合成的調(diào)節(jié)作用；原料的供求和價格最常用的碳源：淀粉及其水解物，如糊精、麥芽糖、葡萄糖等。

（2）氮源氮是組成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要組成元素。凡是能夠向細(xì)胞提供氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為氮源。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩種，有機(jī)氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無機(jī)氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3PO4、尿素等。一般來說，動物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞要求無機(jī)氮。異氧型微生物用有機(jī)氮，自養(yǎng)型微生物用無機(jī)氮。

（3）碳氮比在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的不同而改變的。一般蛋白酶

(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利；淀粉酶(包括α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比略高。

以上是蛋白酶和淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基碳氮比的一般規(guī)律，但是由于菌種很多而其性質(zhì)各異。很難說都是符合上述規(guī)律的。

（4）無機(jī)鹽無機(jī)鹽的主要作用是提供細(xì)胞生命活動不可缺少的無機(jī)元素，并對培養(yǎng)基的pH、氧化還原電位和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。根據(jù)細(xì)胞對無機(jī)元素需要量的大小可分為主要元素和微量元素兩大類。

（5）生長因子生長因子是指細(xì)胞生長繁殖所必不可缺的微量有機(jī)化合物，主要包括各種氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。

（6）產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。產(chǎn)酶促進(jìn)劑大體上分為兩種：誘導(dǎo)物和表面活性劑。產(chǎn)酶誘導(dǎo)物一般是酶作用的底物或底物類似物，或是誘導(dǎo)物的前體物質(zhì)。生產(chǎn)上常采用非離子型表面活性劑，離子型的表面活性劑對微生物有害。

2.2.2.2發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響(1)溫度對產(chǎn)酶的影響溫度是影響細(xì)胞生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收的熱量大于分解反應(yīng)放出的熱量，發(fā)酵液需要升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時，情況則相反，發(fā)酵液溫度就自行上升，加上通風(fēng)攪拌所帶來的熱量，這時，發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長繁殖和產(chǎn)酶所需的適宜溫度。微生物生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨菌種和酶的性質(zhì)不同而異，二者往往不一致。如紅曲霉生長溫度35~37℃，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為37～40℃。生長階段控制在最適生長溫度，以利于細(xì)胞生長繁殖；產(chǎn)酶階段，溫度控制在產(chǎn)酶最適溫度。(2)pH對產(chǎn)酶的影響種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH通常接近該酶反應(yīng)的最適pH。一般來說，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。在發(fā)酵過程中，微生物不斷分解和同化營養(yǎng)物質(zhì)，同時排出代謝產(chǎn)物。這些產(chǎn)物都與pH有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液pH在不斷發(fā)生變化。這些變化常常引起細(xì)胞生長和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對產(chǎn)酶帶來不利的影響。

生產(chǎn)中通常采用控制pH的方法：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C/N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過高時用糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH過低時，通過氮調(diào)節(jié)。(3)通風(fēng)量對產(chǎn)酶的影響通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來說，在發(fā)酵初期，雖然幼細(xì)胞呼吸強(qiáng)度大，耗氧多，但由于菌體少，相對通風(fēng)量可以少些；菌體生長繁殖旺盛期時，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；產(chǎn)酶旺盛時的通風(fēng)量因菌種和酶種而異，一般需要強(qiáng)烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量過多反而抑制酶的生成。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動測定和記錄溶解氧的儀表。(4)攪拌的影響攪拌有利于熱交換、營養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶氧量，增加空氣利用。攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生剪切力，易使細(xì)胞受損。同時攪拌也帶來一定機(jī)械熱，易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關(guān)。(5)中間補(bǔ)料的影響中間補(bǔ)料是在發(fā)酵過程中補(bǔ)充某些營養(yǎng)物料，滿足微生物的代謝活動和合成發(fā)酵產(chǎn)品的需要。中間補(bǔ)料可促使微生物在培養(yǎng)中期的代謝活動受到控制，延長發(fā)酵產(chǎn)物的分泌期，推遲菌種的自溶期，維持較高的發(fā)酵產(chǎn)物增長幅度，并增加發(fā)酵體積，從而使單罐產(chǎn)量大幅度上升。(6)泡沫的影響泡沫的存在阻礙CO2的排除，影響溶氧量，同時泡沫過多影響補(bǔ)料，也易使發(fā)酵液溢出罐外造成跑料。消泡措施：機(jī)械消泡化學(xué)消泡

消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮。理想的消泡劑，其表面相互作用力應(yīng)低，而且應(yīng)難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。(7)濕度用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)酶制劑時，一般前期濕度低些，培養(yǎng)后期濕度大些，有利于產(chǎn)酶。2.3酶的分離純化酶的分離純化目的在于獲得一定量的、不含或少含雜質(zhì)的酶制品或者提純?yōu)榻Y(jié)晶，以利于在科學(xué)研究或生產(chǎn)中的應(yīng)用。酶的分離純化的一般步驟包括選材、細(xì)胞破碎、酶的抽提、分離、純化、結(jié)晶，以及酶的純度鑒定和保存。材料的選擇及前處理破細(xì)胞抽提濃縮與初步提純注意點除了少數(shù)例外，所有操作都應(yīng)在低溫下條件下進(jìn)行，尤其在有有機(jī)溶劑存在時更應(yīng)特別小心大多數(shù)酶在pH<4或pH>10的情況下不穩(wěn)定，故必須控制整個系統(tǒng)不要過酸或過堿；同時要避免在調(diào)節(jié)pH時產(chǎn)生局部酸堿過量的現(xiàn)象。酶和其它蛋白質(zhì)一樣，常易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，故操作中應(yīng)盡量減少泡沫形成。重金屬、有機(jī)溶劑等能使酶變性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞，所有這些也都應(yīng)予以足夠的重視。酶原料選擇的原則：酶含量多、干擾物質(zhì)少；來源豐富、保持新鮮；容易得到、提取工藝簡單；穩(wěn)定性好、安全性好；有綜合利用價值2.3.1酶原料的選擇2.3.2.1生物組織的破碎

(1)研磨法/組織搗碎法利用機(jī)械力的攪拌、剪切、研碎細(xì)胞。常用的有高速組織搗碎機(jī)、高壓勻漿泵、或直接用研缽研磨等。2.3.2酶的提取(2)超聲波法使用超聲波破碎儀所產(chǎn)生的超聲波（10-15kHz）機(jī)械震動后對組織細(xì)胞產(chǎn)生的空化作用使細(xì)胞破碎。主要問題：

超聲空穴局部過熱引起酶活性喪失，所以超聲振蕩處理的時間應(yīng)盡可能短，容器周圍以冰浴冷卻處理，盡量減小熱效應(yīng)引起的酶失活。(3)滲透壓法細(xì)胞在高滲溶液（如蔗糖溶液）中平衡一段時間后，突然轉(zhuǎn)入低滲溶液中，細(xì)胞壁由于滲透壓的突然變化而溶脹破碎。該方法對具有堅韌的多糖細(xì)胞壁的細(xì)胞，如植物、細(xì)菌和霉菌不太適用，除非用其他方法先除去這些細(xì)胞外層堅韌的細(xì)胞壁。(4)凍融法細(xì)胞在低溫冰凍后再在室溫融化，反復(fù)凍融就能使細(xì)胞壁破裂。所需設(shè)備簡單，普通家用冰箱的冷凍室即可進(jìn)行凍融。一般需在凍融液中加入蛋白酶抑制劑，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、絡(luò)合劑EDTA、還原劑DTT(二硫蘇糖醇)等以防破壞目的酶。(5)酶消化法利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶對細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的酶解作用，使細(xì)胞崩解破碎。將革蘭氏陽性菌(如枯草桿菌)與溶菌酶一起溫育，就能得到易破碎的原生質(zhì)體；幾丁質(zhì)酶和3－葡聚糖酶則常用于水解曲霉、面包霉等的細(xì)胞壁。(6)化學(xué)破碎法應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞的方法。常用的化學(xué)試劑分為有機(jī)溶劑和表面活性劑兩大類。①有機(jī)溶劑處理常用的有機(jī)溶劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿。有機(jī)溶劑可使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。②表面活性劑處理表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過性。丙酮干粉的制備破細(xì)胞等處理后可將材料制成丙酮干粉(acetonepowder)，一般程序是：先將材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低溫條件下，加入5~10倍預(yù)先冷至約-20℃的丙酮。迅速攪拌均勻，隨即過濾，最后低溫干燥，研磨過篩。丙酮處理一方面能有效地破壞細(xì)胞壁，另一方面有利于除去大量的脂類雜質(zhì)，同時還能使某些膜結(jié)合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。2.3.2.2酶的提取

酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱作酶的抽提。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中，要注意控制好溫度、pH值等各種條件。抽提劑由于大多數(shù)酶屬于球蛋白類，一般都溶于稀鹽、稀酸或稀堿溶液。但抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及如何最有利于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系。

抽提液＝離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑十pH緩沖劑＋溫度效應(yīng)劑

(KCl、NaCl、蔗糖)(各種緩沖液)(甘油、二甲基亞砜)

＋蛋白酶抑制劑＋防氧化劑

(PMSF、DIFP)(DTT巰基乙醇)

＋重金屬絡(luò)合劑＋增溶劑

(EDTA、檸檬酸)(TritonX－100)典型的抽提液由以下幾部分組成：酶的主要提取方法(1)鹽溶液提取大多數(shù)酶溶于水，而且在一定濃度的鹽存在條件下，酶的溶解度增加，這稱之為鹽溶現(xiàn)象，然而鹽濃度不能太高，否則溶解度反而降低，出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。一般采用稀鹽溶液進(jìn)行酶的提取，鹽濃度一般控制在0.02~0.5mol/L。α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol/L的氯化鈉溶液或0.02~0.05mol/L的磷酸緩沖液提??；酵母醇脫氫酶用0.5~0.6mol/L的磷酸氫二鈉溶液提??；6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L的碳酸鈉提?。嚎莶輻U菌堿性磷酸酶用0.1mol/L的氯化鎂提取。(2)酸溶液提取有些酶在酸性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。例如，從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12mol/L的硫酸溶液進(jìn)行提取。

(3)堿溶液提取有些在堿性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶，應(yīng)采用堿溶液提取。例如，細(xì)菌L-天門冬酰胺酶的提取是將含酶菌體懸浮在pH11~12.5的堿溶液中，振蕩20min，即達(dá)到顯著的提取效果。(4)有機(jī)溶劑提取有些與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團(tuán)較多的酶，不溶或難溶于水、稀酸、稀堿和稀鹽溶液中，需用有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑是與水能夠混溶的乙醇、丙酮、丁醇等2.3.3酶的純化

酶的分離純化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來或者將雜蛋白從酶溶液中除去?，F(xiàn)有酶的分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。

根據(jù)酶和雜蛋白的性質(zhì)差異，它們的分離方法可分為：（1）根據(jù)分子大小而設(shè)計的方法。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。（2）根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法等。（3）按分子所帶正負(fù)電荷多少分離的方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。（4）按穩(wěn)定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法、選擇性酸堿變性法、選擇性表面變性法等。（5）按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法、親和電泳法等。酶的分離純化方法酶的分離純化方法等電點沉淀法原理：在低離子強(qiáng)度下，調(diào)pH至等電點，使蛋白質(zhì)所帶靜電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水能力使分子間相互吸引，形成沉淀。不同的酶和蛋白質(zhì)等電點不同，可以使pH達(dá)到某種酶的等電點，使其沉淀與其他物質(zhì)分離開來。優(yōu)點：很多酶的等電點都在偏酸性范圍內(nèi)，而無機(jī)酸通常價格較廉，并且某些酸（如磷酸、鹽酸和硫酸）的應(yīng)用能為蛋白質(zhì)類食品所允許。同時，也可直接進(jìn)行其他純化操作，無需將殘余的酸除去。缺點：酸化時易使酶失活，這是由于酶對低pH比較敏感。

鹽析法低濃度的中性鹽可增加電解質(zhì)類物質(zhì)（蛋白質(zhì)、酶及其復(fù)合物）的溶解度，被稱為鹽溶現(xiàn)象；但當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時，蛋白質(zhì)的溶解度反而降低而沉淀出來，稱為鹽析。原理：鹽離子與酶和蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，減弱了酶和蛋白質(zhì)的水合程度，使溶解度降低；鹽離子所帶電荷部分中和了酶和蛋白質(zhì)分子上所帶電荷，使其靜電荷減少，酶和蛋白質(zhì)也易沉淀。不同酶和蛋白質(zhì)會在不同的中性鹽濃度下析出。在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。有機(jī)溶劑沉淀法原理：

加入有機(jī)溶劑于酶溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來，使酶沉淀。其中主要效應(yīng)是水的活度的降低。當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時，水對酶分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，因而靜電吸力增大。在疏水區(qū)域附近有序排列的水分子可以為有機(jī)溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了疏水性特別強(qiáng)的酶外，對多數(shù)酶來說，后者影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致酶分子聚集而沉淀。

優(yōu)點：