植物dna提取的研究進展

植物dna提取的研究進展

dna提取是植物酶的基本技術(shù)。目前,已經(jīng)發(fā)展了多種方法,成功地從植物葉片、愈傷組織、組培苗、果實、韌皮部等組織器官中提取出DNA。但是有些情況下,不同植物甚至是同一種類植物組織材料的來源、部位、形態(tài)等外在性質(zhì)的不同以及化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)等內(nèi)在特點的差異,在提取基因組DNA時需要選擇不同的方法或作一些特殊的處理。從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質(zhì)的木本植物中提取的方法難度就相對大于大多數(shù)的禾谷類及蔬菜類植物。從這些植物中分離出的DNA由于多酚被氧化成棕褐色,多糖、單寧等物質(zhì)與DNA會結(jié)合成粘稠的膠狀物,獲得的DNA常出現(xiàn)產(chǎn)量低、質(zhì)量差、易降解,影響了DNA質(zhì)量和純度,不能被限制性內(nèi)切酶酶切,嚴(yán)重的甚至不能作為模板進行PCR擴增。針對這一現(xiàn)象,已有許多學(xué)者對植物特別是頑拗型木本植物的基因組DNA提取純化進行了改良和發(fā)展。筆者就植物DNA提取各個環(huán)節(jié),如樣本的采集與保存、提取緩沖液成分的作用、DNA提取純化方法等進行歸納,同時對DNA提取過程中的常見問題、原因及應(yīng)對策略作簡要的分析。1植物組織材料樣品的保存植物組織材料的采集與保存對提取DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量有很大影響。通常應(yīng)盡可能采集新鮮、幼嫩的組織材料,采集的過程中應(yīng)盡可能使組織材料保持水分,在取樣時立即用浸濕的紗布包裹采集的組織材料,放置在密閉的冰盒中,這樣可使組織材料3~5d仍然保持新鮮。野外遠(yuǎn)距離采集樣本時,在可能的條件下冷凍保存(如放置于液氮中);當(dāng)不具備冷凍條件時,最好用盛有無水CaSO4的瓶子分別保存,使其迅速干燥,這種方法可將材料保存數(shù)月,返回后應(yīng)盡快進行DNA的提取工作。對具有大量次生代謝物(如丹寧、酚類、醌類等)的植物材料,應(yīng)盡可能采集幼嫩組織外,最好進行冷凍保存并在短時間內(nèi)進行DNA提取。植物組織材料的化學(xué)保存法,如乙醇、丙二醇處理法,通常會導(dǎo)致DNA劇烈降解,因此,不作為推薦的保存方法。對于采集回來的樣品如要長期保存,應(yīng)經(jīng)液氮處理后貯存在-80℃冰箱或直接儲放于液氮中,且在與提取緩沖液接觸前,應(yīng)防止冰凍的樣品在空氣中融化,否則酚類易被氧化。2緩沖液及緩沖劑的組分隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,DNA分離技術(shù)也層出不窮,DNA已經(jīng)可以從諸如化石、木乃伊等極端材料中分離出來,也可以從痕量材料獲得DNA。無論是什么材料,針對不同的來源和特點,調(diào)整設(shè)計相應(yīng)的提取緩沖液及不同的技術(shù)方案是十分重要的。在實際應(yīng)用中可針對不同的情況對具體實驗方案的各個部分進行不同組合。緩沖液的成分應(yīng)根據(jù)分離對象的不同而變化,緩沖液的pH值、保護劑和表面活性劑都要根據(jù)不同樣品進行優(yōu)化。十二烷基磺酸鈉(SDS)是一種陽離子強表面活性劑,通常與蛋白酶K和抗氧化劑、螯合劑一起使用;而十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)是一種在高鹽下能與核酸結(jié)合形成可溶、穩(wěn)定的復(fù)合物,低鹽濃度下可沉淀的表面活性劑。乙二胺四乙酸(EDTA)可用于抑制金屬離子依賴性的酶(螯合Mg2+、Ca2+)的活性。牛血清白蛋白(BSA)可使一些降解酶的表面變性。還原型巰基成分如β-巰基乙醇、谷胱苷肽、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等一些硫醇類物質(zhì),通?？捎糜诒ＷoDNA免受醌類物質(zhì)、二硫化物、多酚氧化酶等物質(zhì)的損害。加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)也可減少酚類、醌類及丹寧類物質(zhì)的影響。還有其他一些非通用添加物,如抗壞血酸、維生素C可用于降低醌類物質(zhì)的影響,精胺及其他多胺可用于降低核酶的影響,氰化物可用于降低重金屬氧化酶的影響。另外還有在提取液中加入活性炭、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、重過亞硫酸鈉、硼砂等物質(zhì)防止多酚類物質(zhì)氧化的報道。3提取dna的方法3.1鹽中ctab-核酸混合物sds法傳統(tǒng)的DNA提取與純化,如CTAB法、SDS法是在裂解細(xì)胞的基礎(chǔ)上,多次苯酚氯仿等有機溶劑抽提使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機相,而核酸保留在水相,達(dá)到分離核酸的目的;加入RNA酶除去核酸中的RNA;然后加入異丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70%乙醇漂洗沉淀,除去分離過程中殘留的有機溶劑和鹽離子,以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應(yīng),最后用TE溶解DNA備用。CTAB是一種陽離子去污劑,能與核酸形成復(fù)合物,此復(fù)合物在高鹽(>0.7mol/L)濃度下可溶,并穩(wěn)定存在,但在低鹽濃度(0.1~0.5mol/LNaCl)下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。通過有機溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。經(jīng)離心棄上清后,CTAB-核酸復(fù)合物再用70%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。SDS是一種陰離子去垢劑,在高溫(55~65℃)條件下能裂解細(xì)胞,使染色體離析、蛋白變性,同時SDS與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合成復(fù)合物,釋放出核酸;提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度(冰浴),使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式,使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全,離心后除去沉淀;上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法操作簡單,溫和,也可提取到高分子量的DNA,但所得到的產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多?；蚪MDNA經(jīng)典的提取方法由于無需昂貴儀器和藥品,提取的DNA純度能夠滿足一般分子生物學(xué)的需要,一直作為DNA提取的常規(guī)方法。但這種方法操作步驟復(fù)雜,耗時長,易交叉污染,殘留在DNA溶液中有機物質(zhì)對DNA聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有機溶劑易造成環(huán)境污染,有損操作者健康,因此使該方法的應(yīng)用受到一定的局限性。3.2玻璃粉懸浮液提取dna近年來出現(xiàn)了以螯合樹脂、特異性DNA吸附膜、離子交換純化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基礎(chǔ)DNA提取新方法。這些方法主要應(yīng)用于提取病毒、微生物、人和動物細(xì)胞、包埋組織樣品、古生物標(biāo)本及土壤環(huán)境樣品DNA。已有多篇利用純化柱和玻璃粉純化植物基因組DNA的報道。馬小軍等將CTAB液提取和氯仿抽提兩步的上清液直接通過Wizard純化系統(tǒng)純化得到的DNA,RAPD擴增效果良好,產(chǎn)率達(dá)2250μg/g。張博等用硅珠(SiO2)顆粒吸附DNA純化方法,從不同樹木葉片中均得到了高質(zhì)量的DNA樣品。黃椰林等對常規(guī)CTAB法提取的DNA用玻璃粉懸浮液純化,所獲DN的APCR產(chǎn)物能直接測序,比較適用于富含黏多糖、單寧、多酚和萜類化合物等次生代謝物的植物樣品和長期保存的標(biāo)本材料。袁長春等也用玻璃粉吸附法從富含酚類的茶類植物中提取純凈的總DNA。目前國內(nèi)外開發(fā)了多種商品化的DNA提取純化試劑盒,其分離原理有的利用核酸的分子量差異,有的利用特異性膜與DNA結(jié)合達(dá)到分離、回收的目的,如離子交換柱、磁珠等。這些試劑盒針對不同的材料來源設(shè)計了不同的提取方法,操作簡單、高效,DNA質(zhì)量較高,但價格昂貴,提取量少。著名的國外的試劑盒生產(chǎn)廠家有Sigma-Aldrich、Promega、Invitrogen、TaKaRa、Whatman等,它們針對不同來源的材料如微生物、動物體液、血液和組織、植物、加工產(chǎn)品、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品等開發(fā)出一系列的試劑盒。國內(nèi)的生物公司發(fā)展迅速,如上海生工、北京天為、北京博奧等也開發(fā)了系列試劑盒,質(zhì)量與國外廠家相當(dāng),價格較低。除此之外,由于核酸提取純化試劑盒制作門檻低,還有大量的生物公司提供試劑盒產(chǎn)品,使用者一定要慎重選擇。DNA試劑盒經(jīng)過了幾十年的發(fā)展,已經(jīng)不再局限于單純的提取純化,有些廠家推出了DNA提取—擴增PCR試劑盒,將DNA提取和PCR擴增結(jié)合起來,極大的提高了工作效率,如Sigma-Aldrich公司的Sigma’sExtract-N-AmpPlantPCRkit等。另外,還有高通量的DNA提取產(chǎn)品,如高通量組織細(xì)胞研磨儀MM301,在常溫和冷凍條件下對硬性、中硬性、韌性、脆性及纖維材料的研磨破碎,每次處理樣品的個數(shù)可以多達(dá)48個甚至192個。美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司6100型核酸提取儀,可用于RNA、DNA的提取純化,可自編程序,可選預(yù)設(shè)的程序,具有嚴(yán)格的防交叉污染體系,可從不同來源的樣品中同時提取96個樣品。4dna純度和雜質(zhì)去除4.1pv和基乙醇對植物中次生產(chǎn)物酚類物質(zhì)的去除,普遍是在提取液中加入適量的抗氧化劑和螯合劑,防止多酚氧化褐變。在提取DNA過程中加入巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽及抗壞血酸等巰基試劑,抑制氧化反應(yīng),避免褐化。在樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入高分子螯合劑PVP(聚乙烯吡咯烷酮)或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)等能絡(luò)合多酚和萜類物質(zhì)離心或氯仿抽提出去,有效的防止多酚物質(zhì)氧化成醌類,避免溶液變褐而具有抗氧化作用。因此在提取液中加入適量的PVP或PVPP能提高DNA的純度),其用量視雜質(zhì)的多少而定(1%~6%),PVP同時能有效去除多糖。因此將PVP和巰基乙醇配合使用并調(diào)整用量,能夠有效地防止多酚污染。王玉成等認(rèn)為以上的方法僅對褐化現(xiàn)象較輕者有效,卻很難克服一些含酚類化合物豐富的植物,如檉柳、冷杉等樹種的褐化。在CTAB緩沖液加入一定量的硼砂(提取緩沖液含0.0125mol/L硼砂、2%CTAB、1.4mol/LNaCl、巰基乙醇0.1mol/L,pH值為9.0)提取檉柳、冷杉的RNA取得了良好的效果,而且在提取紫丁香、糖槭、旱柳等植物組織的RNA時也從未發(fā)生褐化。4.2dna的純化多糖的污染是提取植物DNA時常遇到的另一棘手的問題。植物組織中往往富含多糖,而多糖的許多理化性質(zhì)與DNA很相似,因此很難將它們分開。經(jīng)典的CsCl梯度離心能有效的除去植物中多糖,但梯度離心設(shè)備昂貴,操作不便且DNA得率很低。近年國內(nèi)外有一些去除多糖的相關(guān)報道,Dellaporta等認(rèn)為加入高濃度的KAc有利于除去多糖;Fang等認(rèn)為在1.0~2.5mol/LNaCl的高鹽TE中,用無水乙醇沉淀DNA能除去多糖;SuePorebski等在沉淀粗提DNA時,將NaCl的濃度提高至2.5mol/L以除去多糖;Candelario等通過調(diào)節(jié)材料的取樣時期、使用量,在氯仿處理后加含2%CTAB的分離緩沖液,及延長離心時間等方法來有效去除仙人掌植物的多糖;徐志祥等將DNA沉淀重懸于30%乙醇中4℃放置過夜,離心,上清加乙醇至80%重新沉淀DNA,能去除多糖和其他雜質(zhì);陳大明等利用活細(xì)胞中由于細(xì)胞區(qū)室化多酚類以及其他雜質(zhì)與DNA相互隔離的特性,在裂解細(xì)胞前用不含CTAB的提取緩沖液(0.14mol/L葡萄糖、3%可溶性PVP、10mmol/Lβ-巰基乙醇)去除細(xì)胞質(zhì)中大多數(shù)生化成分,同時有效地防止多酚類物質(zhì)被氧化,從而達(dá)到排除多酚類等雜質(zhì)干擾的目的;程運江等先用水飽、乙醚和1.2~1.5mol/LNaCl溶液將大部分多糖去除,再用2倍乙醇沉淀DNA可大大提高效率。AnMichiels等用生長2~4月的幼苗轉(zhuǎn)移到暗室暗化處理4周的黃化葉提取DNA有效地防止多糖污染,同時發(fā)現(xiàn)在25℃異丙醇過夜沉淀DNA能減少雜質(zhì)污染且大大提高產(chǎn)率。關(guān)于提取DNA中蛋白質(zhì)、糖類、多酚等各種雜質(zhì)對分子生物學(xué)后續(xù)試驗的影響,馬小軍等和文曉鵬等認(rèn)為在一定范圍內(nèi)DNA樣品中蛋白質(zhì)含量的高低,可能不是影響PCR擴增的重要因素,去除RNA后尚未純化的DNA作為模板進行RAPD擴增也能得到和純化后一致的條帶。但是,用EcoRI和HindIII檢測表明,未純化的DNA不能用于酶切。目前檢測DNA的純度最常用的方法是測定DNA在230、260、280nm的吸收值,通過計算OD260/OD280來評價DNA的純度,通常認(rèn)為OD260/OD280在1.8~2.0表明DNA的純度較好。盡管這種方法用得很普遍,但并不可靠,因為核酸在260nm處的吸收很強,只有存在高水平蛋白質(zhì)雜質(zhì)時才會引起這2個波長下吸收值的比值發(fā)生明顯改變。檢測DNA純度最佳的辦法是采用EcoRI、HindIII等限制性核酸內(nèi)切酶對DNA進行酶切消化,只有能被酶切完全并可用作PCR模板的基因組DNA,才能證明其純度高,所含蛋白質(zhì)、多糖類等雜質(zhì)少,才能進一步用于AFLP、RFLP、Sou