動(dòng)物dna提取方法的研究進(jìn)展

動(dòng)物dna提取方法的研究進(jìn)展

隨著酶原的發(fā)展，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行了物種識(shí)別、物種起源、多樣性、親水性和系統(tǒng)進(jìn)化的研究是目前動(dòng)物分子學(xué)研究的最有效手段。然而,由于野外取材的局限性,很多材料都必須經(jīng)過處理后,帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行DNA提取,加大了提取DNA的難度,從而導(dǎo)致進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的不穩(wěn)定性,造成資源和時(shí)間的浪費(fèi)。因此,總結(jié)不同保存條件下提取結(jié)構(gòu)完整DNA方法是很有必要的,本文將近年來諸多動(dòng)物DNA提取方法進(jìn)行了比較綜述。1從損傷中提取的材料dna1.1個(gè)二價(jià)陽離子輔助用乙醇保存動(dòng)物標(biāo)本是最常用且最有效的一種方法,王義權(quán)等和蔡振媛等曾比較過用含50mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的70%乙醇、70%乙醇保存動(dòng)物材料的DNA提取,發(fā)現(xiàn)含50mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的70%乙醇材料DNA降解較少。由于大多數(shù)DNA酶需要一個(gè)二價(jià)陽離子作為輔助因子(如Ca2+、Mg2+等),在70%的乙醇中加入適量EDTA,EDTA可以迅速抑制DNA酶的活性,進(jìn)一步減少DNA的降解。莫邦輝等在酒精標(biāo)本DNA模板快速提取中沒有用蛋白酶K,僅在緩沖液(0.5%SDS,10mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,pH8.0),37℃溫浴1h作用下消化材料,也獲得了較好的擴(kuò)增結(jié)果,但本方法僅適用于短片段的PCR擴(kuò)增。一般經(jīng)典酒精標(biāo)本DNA提取方法都會(huì)加入蛋白酶K,且在56℃條件下消化8~14h,以達(dá)到組織中蛋白質(zhì)的完全消化。田宗城等認(rèn)為在提取乙醇保存的組織標(biāo)本之前,先將標(biāo)本在蒸餾水中清洗過夜,除去標(biāo)本中的酒精,減少對(duì)蛋白酶K活性的影響,同時(shí)在提取過程中將稍微剪碎的尾鰭組織小塊直接放入DNA提取液中,37℃水浴過夜,這樣得到的DNA機(jī)械斷裂的機(jī)會(huì)少,提取液經(jīng)RNA酶處理,酚、氯仿和異戊醇反復(fù)抽提,即可得較純的DNA產(chǎn)物。1.2樣品處理和dna提取在以往的研究中對(duì)于福爾馬林標(biāo)本的DNA提取方法已經(jīng)有了較大的改進(jìn),首先,在預(yù)處理標(biāo)本上,有梯度酒精浸泡和臨界點(diǎn)干燥法。而用梯度酒精預(yù)處理標(biāo)本的方法,使乙醇與標(biāo)本中的甲醛反應(yīng)生成半縮醛和縮醛,再通過酒精更換被清除出標(biāo)本。許黎美等認(rèn)為將兩種預(yù)處理方法結(jié)合起來使用,效果更佳。徐來祥等為了防止標(biāo)本大量吸水造成細(xì)胞嚴(yán)重破壞,采用PBS溶液(磷酸緩沖液PhosphateBufferSolution)結(jié)合乙醇溶液浸泡洗脫樣品,也取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在DNA提取過程中,周美玉等和杜世章等都用了一種抗氧化劑二硫蘇糖醇(DTT),DTT能有效地抑制甲醛進(jìn)一步氧化為甲酸,而甲酸會(huì)造成DNA的降解,因此抗氧化劑的加入對(duì)基因組DNA的提取起著關(guān)鍵性作用。Paabo和Su也曾提出在提取過程中要加入DTT,以提高DNA的產(chǎn)率。同時(shí),Baneljee等提出福爾馬林保存標(biāo)本在空氣中暴露時(shí)間越長(zhǎng),福爾馬林發(fā)生氧化程度就越大,其提取的DNA完整性就越低。徐來祥等的實(shí)驗(yàn)也證明了這種觀點(diǎn),保存時(shí)間較長(zhǎng)的鰻鱺標(biāo)本由于密封較好,氧化程度低,反而比保存時(shí)間短但密封性不好的倉鼠肝臟中提取的DNA更完整。1.3酚-氯反復(fù)抽提法DNA提取中回顧性的研究大多都是從石蠟包埋組織中提取的。經(jīng)典的石蠟包埋組織DNA提取是用二甲苯脫蠟,蛋白酶K消化,酚-氯仿反復(fù)多次抽提,這種方法不僅操作復(fù)雜,污染大,而且提取的DNA部分?jǐn)嗔?丟失,嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,為此,很多學(xué)者做了進(jìn)一步的改進(jìn)。如:經(jīng)典的快速提取DNA方法是沒有經(jīng)過酚-氯仿反復(fù)抽提,直接將含有蛋白酶K的裂解液置于37℃恒溫水浴3h后,95℃加熱10min,1400r/min離心5min即可,這種方法既避免了酚-氯仿反復(fù)抽提對(duì)人體的傷害,同時(shí)也簡(jiǎn)化了步驟,提高效率。叢娟等在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了部分改進(jìn):將含有蛋白酶K裂解液的標(biāo)本,置于70℃恒溫水浴,再將消化過程中的標(biāo)本置于55℃恒溫水浴過夜,后再經(jīng)酚-氯仿反復(fù)抽提,也得到了較純的DNA產(chǎn)物,但操作還是相當(dāng)復(fù)雜,易污染。高凌云等又提出了一種簡(jiǎn)易的提取方案,此方法不用二甲苯脫蠟,而加入了非離子去污劑Tween20,通過改變細(xì)胞膜表面的張力,來加強(qiáng)蛋白酶K對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用。避免了傳統(tǒng)二甲苯脫蠟造成DNA破壞,引起PCR產(chǎn)物陽性率降低,減少了二甲苯對(duì)人體的危害,同時(shí),提取的整個(gè)過程在一個(gè)EP管中完成,避免了繁瑣而費(fèi)力的酚-氯仿反復(fù)抽提造成的DNA丟失和污染,保證PCR反應(yīng)的質(zhì)量,還可以處理大量標(biāo)本,達(dá)到快速、經(jīng)濟(jì)目的。2非損傷性取樣:量遺傳物質(zhì)檢測(cè)新方法80年代中期以來,由于PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用,已經(jīng)能對(duì)極少量遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),由此產(chǎn)生了一類新的取樣方法——非損傷性取樣(noninvasivesampling)。這種方法的樣品來源可以是動(dòng)物的皮張標(biāo)本、脫落的毛發(fā)、糞便、尿液等。2.1價(jià)金屬離子絡(luò)合利的作用從陳舊皮張中提取DNA,目前,已有不少學(xué)者在某些實(shí)驗(yàn)對(duì)象上取得了成功,但往往都過于煩瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),因此,很多學(xué)者希望能找到更好的提取方案。饒剛等認(rèn)為在提取過程中加入Chelex(螯合樹脂)能提高DNA的產(chǎn)率,在高溫條件下一些金屬離子可以作為DNA降解的催化劑作用,而Chelex是一種對(duì)多價(jià)金屬離子具高親合力的一種螯合樹脂,能通過螯合這些金屬離子來阻止DNA的降解,這樣可從微量樣品中得到較高分子量的DNA。同時(shí),由于陳舊皮張中含有大量的角蛋白、膠原蛋白等對(duì)蛋白酶K有著較強(qiáng)耐受性的蛋白,為了能很好地消化材料,繞剛等又提出了在對(duì)標(biāo)本前處理時(shí),消化液組分中以鈣鹽代替鈉鹽,這是由于蛋白酶K有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn),它們與催化機(jī)理雖無直接關(guān)系,但如果從該酶中除去Ca2+,由于出現(xiàn)遠(yuǎn)程的結(jié)構(gòu)變化,催化活性將喪失80%左右。所以,加入含Ca2+的消化液,增強(qiáng)消化液的消化效果,可以使實(shí)驗(yàn)周期成倍縮短,也簡(jiǎn)化了操作步驟。同樣,為了更好地消化材料,蘭宏等采用了含有膠原蛋白和胰蛋白酶的PBS消化液,這是由于膠原蛋白能在適當(dāng)?shù)臈l件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu);而胰蛋白酶能選擇地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈,能消化溶解變性蛋白質(zhì)。同時(shí),Paabo認(rèn)為從動(dòng)物死亡到標(biāo)本完全干燥的時(shí)間越長(zhǎng),標(biāo)本保留的DNA分子就越大,這點(diǎn)對(duì)于DNA提取成敗也起著關(guān)鍵性作用。2.2不同提取方法所獲得dna的量和時(shí)間及對(duì)pcr過程的影響從毛發(fā)中提取DNA,相關(guān)報(bào)道已有很多。余艦等在蛋白酶K(56℃)作用下,采用酚-氯仿反復(fù)抽提法就已經(jīng)從毛發(fā)中提取了微量的DNA。徐艷春等和伍新堯等用Chelex-100處理毛發(fā)制備DNA,達(dá)到1根毛發(fā)提取得到的DNA即可得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,但用此方法對(duì)毛囊細(xì)胞裂解不夠徹底,殘留的消化液對(duì)后繼的PCR過程有一定的影響。而后,李軍林等在常規(guī)的酚-氯仿提取法的基礎(chǔ)上加以優(yōu)化,以pH8.8Tris-HCl、MgCl2溶液和蛋白酶K為裂解液消化,使其獲得了較高質(zhì)量的DNA。趙春江等在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn),以常用的PCR緩沖液、MgCl2溶液和蛋白酶K為裂解液,在PCR上設(shè)置一個(gè)單循環(huán)程序:65℃30min,95℃15min,4℃10min,而后瞬時(shí)離心PCR管,上清液即可做PCR模板。此法采用的較高消化溫度(65℃),可使蛋白酶K在較短時(shí)間內(nèi)高效地消化毛囊中的蛋白質(zhì),使細(xì)胞釋出DNA;PCR的緩沖液中含有的Tris堿和PCR緩沖液的pH值,可在DNA提取過程中起到保護(hù)DNA、防止降解的作用;在PCR儀上,95℃15min過程可使蛋白酶K滅活,防止過剩的蛋白酶K在PCR過程中消化Taq酶而使PCR擴(kuò)增無法進(jìn)行。該方法可以用于大量標(biāo)本的處理,且效果較好。2.3血液dna的提取從血液樣本中提取DNA關(guān)鍵是去除紅細(xì)胞及蛋白質(zhì)。常規(guī)的方法是:先得到淋巴細(xì)胞,再用蛋白酶K、SDS消化,然后用酚氯仿抽提、乙醇沉淀。但此方法操作復(fù)雜,且試劑對(duì)身體有害,不少學(xué)者做了進(jìn)一步的改進(jìn)。趙權(quán)等采用TritonX-100破碎紅細(xì)胞和白細(xì)胞,直接得到白細(xì)胞核,然后用NaClO4,SDS解聚核蛋白,而不用蛋白酶K,最后用PCl(酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1)抽提,乙醇沉淀。此方法在去除紅細(xì)胞方面有了較大提高?；艚瘕埖仍诔Ｒ?guī)方法的基礎(chǔ)上又提出了用含有NH4Cl的等滲溶液破碎去除紅細(xì)胞。這種方法雖然也很好地去除了紅細(xì)胞,但操作等方面還是很復(fù)雜。吳清敏等結(jié)合他們方法稍做改進(jìn),用含有NH4Cl裂解液和含Tris-Cl的核裂解液逐步對(duì)樣本做處理,同時(shí)用蛋白酶K消化,并在54℃水浴2h,加入6mol/LNaCl,而后離心的上清液經(jīng)沉淀洗滌,就獲得了較純的DNA產(chǎn)物。此后,趙嘉惠等又提出了TKM血液DNA提取法,此法利用紅細(xì)胞對(duì)低滲環(huán)境較為敏感,在去污劑NP-40存在下極易被破壞的原理,在溶液中加入NP-40;在高滲狀態(tài)下,強(qiáng)陰離子去污劑SDS可將其他血細(xì)胞及其細(xì)胞器破壞殆盡,經(jīng)離心將細(xì)胞碎片及其他雜質(zhì)除去,從而達(dá)到純化DNA的目的。而后,戴文申等提出了用Chelex-100