基因芯片與第二代dna測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

基因芯片與第二代dna測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

20世紀(jì)80年代，由許多國家參與的人類遺傳因素計(jì)劃被稱為繼曼原子計(jì)劃和阿波羅登月計(jì)劃之后的第三個(gè)科學(xué)計(jì)劃。該計(jì)劃的完成對(duì)人類的認(rèn)識(shí)和健康水平的提高，促進(jìn)生物、醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、制藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的發(fā)展具有極其重要的意義。26.2000年6月，美國、英國、法國、德國、日本和中國科學(xué)家宣布了人類遺傳因素的工作量，這是一份里程碑。隨著人類科學(xué)研究的實(shí)施，人類科學(xué)研究的路徑也得到了促進(jìn)。在此期間，許多復(fù)雜的序列被分解，大量的基因被檢測(cè)為矩陣。下一步，我們必須進(jìn)一步研究這些基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)和分布，并通過高流量、大的分析方法和方法來滿足這些需求。高流量研究的基質(zhì)碎片技術(shù)和最新開發(fā)的第二代dna序列技術(shù)是高流量研究的兩種重要技術(shù)。促進(jìn)了功能矩陣和系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展。本文簡要介紹了這兩種技術(shù)和應(yīng)用，并分析了這兩種技術(shù)在長壽中的應(yīng)用前景。1基因芯片的制備方法生物芯片的概念由Fodor等人在1991年提出是指能夠快速并行處理多個(gè)樣品并對(duì)其所包含的各種生物信息進(jìn)行解剖的微型器件,它的加工運(yùn)用了微電子工業(yè)和微機(jī)電系統(tǒng)加工中所采用的一些方法只是由于其所處理和分析的對(duì)象是生物樣品,所以叫生物芯片(Biochip).在生物芯片技術(shù)中,基因芯片技術(shù)建立最早,也最為成熟.基因芯片,又稱DNA微陣列(DNAmicroarray),是把大量已知序列探針集成在同一個(gè)基片(如玻片、膜)上[2~7],經(jīng)過標(biāo)記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交,通過檢測(cè)雜交信號(hào),對(duì)生物細(xì)胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析.其突出特點(diǎn)在于高度并行性、多樣性、微型化和自動(dòng)化.高度的并行性不僅可以大大提高實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程,而且有利于DNA芯片技術(shù)所展示圖譜的快速對(duì)照和閱讀.多樣性可以在單個(gè)芯片中同時(shí)進(jìn)行樣品的多參數(shù)分析,從而避免因不同實(shí)驗(yàn)條件產(chǎn)生的誤差,大大提高分析的精確性.微型化可以減少試劑用量和減小反應(yīng)液體積,降低實(shí)驗(yàn)費(fèi)用.高度自動(dòng)化則可以降低制造芯片的成本和保證芯片的制造質(zhì)量.1995年Science雜志首次報(bào)道了Schena等人用DNA微陣列技術(shù)并行檢測(cè)擬南芥多個(gè)基因的表達(dá)水平.1994年第一張商業(yè)化基因芯片由Affymetrix公司推出.基因芯片的制備方法主要有兩種:原位合成法和點(diǎn)樣法.從目前應(yīng)用的情況來看,原位合成的基因芯片的密度高,重復(fù)性好,制備過程中的質(zhì)量控制比較容易,但是成本較高.而點(diǎn)樣技術(shù)主要應(yīng)用在部分沒有商業(yè)化芯片的物種的基因芯片的制備,制備的成本較低.原位合成的芯片是今后的一個(gè)發(fā)展和應(yīng)用方向.基因芯片的原位合成法是基于組合化學(xué)的合成原理,通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學(xué)單體的偶聯(lián)位點(diǎn)和次序,把腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四種不同堿基的核苷酸按不同次序化學(xué)偶聯(lián)在相應(yīng)的位點(diǎn),原位合成序列不同的寡核苷酸探針,形成DNA芯片.這一技術(shù)是由Affymetrix公司的Fodor及其同事最先發(fā)明的,他們使用含光敏化學(xué)保護(hù)基的DNA合成試劑,用光脫保護(hù)法直接在基片上合成寡核苷酸探針,即光導(dǎo)向原位合成法.該方法的優(yōu)點(diǎn)在于精確性高,缺點(diǎn)是制造光掩蔽劑既費(fèi)時(shí)又昂貴.美國Wisconsin大學(xué)的Singh-Easson等人利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的虛擬掩模來制備DNA芯片,他們使用一種包括480000個(gè)微小鋁鏡陣列的光學(xué)數(shù)字微鏡設(shè)備,通過計(jì)算機(jī)精確地控制光線在微鏡上的反射方向,將紫外光束直接照射到玻璃基片上,從而在基片的特定區(qū)域上選擇性地脫除保護(hù)基.采用虛擬掩模技術(shù)不用耗資費(fèi)時(shí)去加工光掩模,降低了基因芯片的制備時(shí)間和成本.Nimblegen公司利用這一技術(shù)進(jìn)行了高密度芯片的商業(yè)化生產(chǎn).國內(nèi)的東南大學(xué)生物芯片研究小組,結(jié)合組合化學(xué)合成與軟光刻微印刷技術(shù)的原理,用一套組合的分子印章印刷的方式——壓印的方式分配DNA合成試劑到基片的特定位點(diǎn),多次壓印直至指定的探針微陣列形成而制得DNA芯片.該技術(shù)利用預(yù)先制作的分子印章實(shí)現(xiàn)空間尋址原位合成,設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)暮铣身樞蚺c設(shè)計(jì)凹凸位點(diǎn)不同的印章即可在基片上原位合成出位置和序列預(yù)定的寡核苷酸或寡肽陣列.東南大學(xué)利用軟光刻原位合成法,成功得到特征位點(diǎn)尺寸為100μm與30μm的寡核苷酸微陣列.點(diǎn)樣法制備基因芯片首先按常規(guī)方法制備cDNA(或寡核苷酸)探針庫,然后通過特殊的微噴頭,分別把不同的探針溶液按照預(yù)先排定的順序逐點(diǎn)點(diǎn)在片基表面,并通過物理和化學(xué)作用使探針固定于基片表面.探針片段除了可使用寡聚核苷酸探針,也可使用較長的基因片段以及核酸類似物探針(如PNA等).點(diǎn)樣法的優(yōu)越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸或cDNA探針庫,探針的長度可以任意選擇,靈活性大,可根據(jù)需要自行制備.最早的點(diǎn)樣裝置是由Stanford大學(xué)的Shalon和Brown等研究人員自己搭建研制的,美國的CartesianTechnologies,TeleChem,Biodot,PerkinElmer,GEHealthcare等公司,英國的Genetix公司,中國的博奧生物公司等都有商業(yè)成型的點(diǎn)樣機(jī).在基因芯片制備方面除了Affymetrix,Agilent和Nimblegen等幾個(gè)公司外,大多公司普遍采用點(diǎn)樣技術(shù)制作DNA芯片.20世紀(jì)90年代末,中國政府和科學(xué)家開始啟動(dòng)生物芯片的研究與開發(fā).我國最早的一張DNA微陣列膜,是在中國科學(xué)院的人類基因組項(xiàng)目的支持下,利用了國家人類基因組南方研究中心所積累的大量人類cDNA克隆模板點(diǎn)制成功的.這張“基因芯片”成功地運(yùn)用于首例肝癌及癌旁組織的比較轉(zhuǎn)錄組研究,其成果于2001年發(fā)表于PNAS.“九五”末期,國家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃又連續(xù)撥出?？?支持北京、上海和南京若干個(gè)課題組開始實(shí)施包括基因芯片的“生物芯片”研制工作,成立上海的“華冠”公司專門從事診斷用生物芯片的研發(fā).國內(nèi)若干民營企業(yè)也開始投入對(duì)生物芯片的研發(fā).比較突出的包括廣州“益生堂”、上海“博星”和浙江湖州的“江南生物”等企業(yè).從2000年開始,政府陸續(xù)投入近5億元人民幣,建立了北京、上海兩個(gè)生物芯片國家工程研究中心,國家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃在“十五”和“十一五”期間對(duì)生物芯片技術(shù)的研究與產(chǎn)品的開發(fā)進(jìn)行了重點(diǎn)資助,已經(jīng)取得了一批重要的研究成果和開發(fā)了一批生物芯片產(chǎn)品.如生物芯片北京國家工程研究中心,開發(fā)了基因芯片的掃描儀,基因芯片的點(diǎn)樣儀,雜交儀以及樣品處理的儀器,形成了基因芯片的制備和應(yīng)用的一套儀器設(shè)備.同時(shí),利用自主研發(fā)的基因芯片技術(shù)平臺(tái),開發(fā)了幾十種基因表達(dá)譜芯片、miRNA芯片、CGH芯片、DNA甲基化芯片以及應(yīng)用于食品安全檢測(cè),臨床診斷的基因芯片.生物芯片上海國家工程研究中心,建立了基于點(diǎn)樣的基因芯片技術(shù)平臺(tái),開發(fā)了20余種基因表達(dá)譜芯片和Pathway芯片,主要的物種有人、大鼠、小鼠以及微生物全基因組芯片.同時(shí)還引進(jìn)了國際上用得最多,技術(shù)也最為成熟的Affymetrix,Agilent,Illumina和Nimblegen的系統(tǒng)和體系,建立了嚴(yán)格的質(zhì)量控制和應(yīng)用體系,提供基因芯片的全面解決方案.承擔(dān)了國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973)、國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)和上海市科委的項(xiàng)目,為國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973)、國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)、自然科學(xué)基金和地方政府的項(xiàng)目提供了技術(shù)支持和技術(shù)服務(wù),為完成這些項(xiàng)目提供了技術(shù)保障.通過服務(wù)和合作在PNAS,Genomics,BBRC,JBC,FEBSletter等雜志上發(fā)表了論文.2芯片基因芯片研究的現(xiàn)狀隨著基因芯片技術(shù)的日漸成熟,在功能基因組、疾病基因組、系統(tǒng)生物學(xué)等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用,已經(jīng)發(fā)表了上萬篇研究論文,每年發(fā)表的論文呈現(xiàn)增長的趨勢(shì).芯片制備技術(shù)極大地推進(jìn)了生物芯片的發(fā)展,從實(shí)驗(yàn)室手工或機(jī)械點(diǎn)制芯片到工業(yè)化原位合成制備,從幾百個(gè)點(diǎn)的芯片到幾百萬點(diǎn)的高密度芯片,生物芯片從一項(xiàng)科學(xué)成為一項(xiàng)技術(shù),被越來越多的研究者廣泛運(yùn)用.各個(gè)實(shí)驗(yàn)室不斷產(chǎn)生海量的雜交數(shù)據(jù),相同領(lǐng)域的研究者需要比較不同實(shí)驗(yàn)平臺(tái)產(chǎn)生的數(shù)據(jù),作為基于分子雜交原理的高通量技術(shù),芯片實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化、可信度、重現(xiàn)性和芯片結(jié)果是否能作為定量數(shù)據(jù)等問題成為所有的芯片使用者關(guān)心的課題.邁阿密原則和微陣列質(zhì)量控制系列研究回答了這兩個(gè)問題.邁阿密原則(MinimumInformationAboutaMicroarrayExperiment,MIAME,微陣列實(shí)驗(yàn)最小信息量)提出了生物芯片標(biāo)準(zhǔn)化的概念,該原則的制定使世界各地實(shí)驗(yàn)室的芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以為所有的研究者共享.同時(shí),美國國家生物信息學(xué)中心(NCBI)和位于英國的歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)也建立了GEO2006年美國FDA聯(lián)合多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了MAQC系列實(shí)驗(yàn)(microarrayqualitycontrol,MAQC),旨在研究目前所使用的芯片平臺(tái)的質(zhì)量控制.該研究的12篇系列文章發(fā)表在2006年9月份的NatureBiotechnology上,用嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)分析了目前主流芯片平臺(tái)數(shù)據(jù)質(zhì)量[24~26],芯片數(shù)據(jù)和定量PCR結(jié)果之間的相關(guān)性,芯片數(shù)據(jù)均一化方法,不同芯片平臺(tái)之間的可重現(xiàn)性.證明了不同芯片平臺(tái)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有可比性和可重現(xiàn)性,各種芯片平臺(tái)之間的系統(tǒng)誤差遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于人為操作和生物學(xué)樣品之間本身的差異,肯定了芯片數(shù)據(jù)的可信性,打消了以往對(duì)芯片數(shù)據(jù)的種種猜疑,明確了基于雜交原理的芯片同樣可以作為一種定量的手段.推動(dòng)了生物芯片技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用.生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)是在處理基因芯片產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)中必不可少的工具.隨著芯片應(yīng)用的推進(jìn),芯片數(shù)據(jù)分析的新理論和新算法不斷地被開發(fā)出來,這些方法幫助生物學(xué)家從海量的數(shù)據(jù)里面快速篩選出差異表達(dá)的基因.一次芯片實(shí)驗(yàn)獲得的是成千上萬個(gè)基因的表達(dá)信息,任何一種單一的分析方法都很難將所有蘊(yùn)含在數(shù)據(jù)中的生物學(xué)信息全部提取出來,從近年來生物信息學(xué)研究的趨勢(shì)來看,目前研究的重點(diǎn)開始轉(zhuǎn)向芯片數(shù)據(jù)儲(chǔ)存、管理、共享和深度信息挖掘,旨在從芯片數(shù)據(jù)中獲得更多的生物學(xué)解釋,而不再停留在單純的差異表達(dá)基因篩選上.目前基因芯片的制備向兩個(gè)主要方向發(fā)展.第一,高密度化,具體表現(xiàn)為芯片密度的增加,目前原位合成的芯片密度已經(jīng)達(dá)到了每平方厘米上千萬個(gè)探針.一張芯片上足以分析一個(gè)物種的基因組信息.第二,微量化,芯片檢測(cè)樣品的微量化,目前芯片檢測(cè)下限已經(jīng)能達(dá)到納克級(jí)總RNA水平,這為干細(xì)胞研究中特別是IPS干細(xì)胞對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜研究提供了可能.另一方面,微量化也體現(xiàn)芯片矩陣面積的微量化,即在同一個(gè)芯片載體上平行的進(jìn)行多個(gè)矩陣的雜交,大大減少系統(tǒng)和批次可能帶來的差異,同時(shí)削減實(shí)驗(yàn)費(fèi)用.微陣列技術(shù)改變了生物學(xué)研究的方法,使得微量樣品快速高通量的分析成為可能,從單個(gè)基因的研究迅速擴(kuò)展到全基因組的系統(tǒng)生物學(xué)研究.微陣列技術(shù)幫助生物學(xué)研究進(jìn)入后基因組時(shí)代,研究成果層出不窮.2001年國家人類基因組南方研究中心韓澤廣博士研究小組利用cDNA芯片對(duì)肝癌和正常組織中的12393個(gè)基因和EST序列進(jìn)行了表達(dá)譜篩查,其中發(fā)現(xiàn)了2253個(gè)基因和EST在肝癌中發(fā)生了差異表達(dá),并對(duì)這些差異基因的信號(hào)通路進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)WNT信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生中出現(xiàn)了表達(dá)異常.2002年中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所張旭博士研究組利用表達(dá)譜芯片對(duì)大鼠外周神經(jīng)損傷模型背根神經(jīng)節(jié)的基因表達(dá)進(jìn)行了研究,通過對(duì)7523個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)譜篩查,發(fā)現(xiàn)一批與神經(jīng)損傷和疼痛相關(guān)的基因和潛在的藥物靶點(diǎn),并解釋了臨床上使用的Gabapentin治療疼痛的分子機(jī)制.同年Nature發(fā)表的荷蘭癌癥研究所的研究小組利用表達(dá)譜芯片對(duì)乳腺癌患者5年內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行分子水平的分型工作,研究結(jié)果顯示可以利用基因表達(dá)譜的差異來預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后情況.這項(xiàng)工作成為用表達(dá)譜對(duì)疾病進(jìn)行分子分型和預(yù)后研究的經(jīng)典案例.2006年根據(jù)這項(xiàng)研究成果生產(chǎn)的表達(dá)譜芯片成為第一張通過FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用的表達(dá)譜芯片,邁出了芯片從實(shí)驗(yàn)室走向臨床的第一步.2003年啟動(dòng)的人類基因組單體型計(jì)劃(InternationalHapmapProject)采用了5個(gè)不同的高通量平臺(tái)進(jìn)行基因分型工作,其中芯片完成了超過50%的工作量.2005年Gunderson等人用DNA芯片檢測(cè)人類基因組中的SNP位點(diǎn),芯片的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的基于PCR技術(shù)的基因分型具有非常好的相關(guān)性.Roch的AmplichipCYP450檢測(cè)芯片在2005年通過了FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用,用以檢測(cè)患者體內(nèi)決定細(xì)胞色素氧化酶活性的多態(tài)性位點(diǎn),預(yù)測(cè)患者藥物代謝水平的高低,這也是第一張進(jìn)入臨床檢查的SNP芯片.2007年Burton等人利用微陣列檢測(cè)了1000例四種疾病患者和對(duì)照組的1500例健康人的14000多個(gè)SNP位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)了患者與健康人自身免疫方面存在的基因組SNP位點(diǎn)差異性.2006年國家人類基因組南方研究中心和生物芯片上海國家工程研究中心合作,利用比較基因組雜交(aCGH)和表達(dá)譜芯片聯(lián)合分析了肝癌樣品中基因組拷貝數(shù)變異和基因表達(dá)量變化的相關(guān)性,為從基因組結(jié)構(gòu)變異角度研究肝癌的發(fā)生機(jī)制提供了研究基礎(chǔ).2007年Carter等人報(bào)道利用SNP芯片檢測(cè)基因組拷貝數(shù)變化(copynumbervariation),發(fā)現(xiàn)人類基因組中存在約12%的拷貝數(shù)變異,這一發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)出乎以前人們對(duì)人類基因組多樣性的預(yù)測(cè).2008年Lee等人報(bào)道了用比較基因組雜交(aCGH)對(duì)遺傳疾病進(jìn)行分型,發(fā)現(xiàn)了存在于精神發(fā)育遲緩病人染色體15q13.3區(qū)域的一個(gè)缺失,NatureGenetics刊登了這一結(jié)果.小RNA或非編碼RNA(ncRNA)是新興的一個(gè)研究領(lǐng)域.這類小分子RNA在生理過程中扮演著調(diào)控分子的角色,在發(fā)育過程和人類疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用.這些小分子核酸高度同源,序列差異往往就是一個(gè)堿基,且長度在21~35堿基之間,這對(duì)芯片檢測(cè)是一個(gè)很大的挑戰(zhàn),要求既能檢測(cè)到低分子量的目的片段,又能區(qū)分一個(gè)堿基的差異,芯片技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)部分解決這些問題,利用芯片檢測(cè)小分子RNA的表達(dá)譜成為腫瘤分型的另一種途徑,在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等疾病的分子分型和分子標(biāo)志物尋找中取得非常好的結(jié)果.DNA修飾以及DNA-蛋白質(zhì)相互作用是細(xì)胞對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控方式.2007年Meier等人采用ChIP-chip實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)到了發(fā)生DNA損傷時(shí),相應(yīng)的修復(fù)因子在DNA上的分布.同年,Guenther等人用ChIP-chip實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄起始可能不是特異的,大多數(shù)的人類基因包括原來被證明轉(zhuǎn)錄失活的編碼基因都能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,細(xì)胞通過對(duì)基因組的修飾來控制轉(zhuǎn)錄的延伸過程,從而達(dá)到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的目的.2008年Lupien等人用ChIP-chip和一系列的實(shí)驗(yàn),證實(shí)了基因組表觀遺傳學(xué)修飾能調(diào)控FoxA1,通過FoxA1改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu),從而控制基因的組織特異性表達(dá).基因芯片的應(yīng)用加速了生命科學(xué)研究的進(jìn)程,微量化并行化的分析幫助科學(xué)家從海量數(shù)據(jù)中發(fā)掘有用的信息.3高通量測(cè)序平臺(tái)高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變,一次對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定,因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測(cè)序技術(shù)(nextgenerationsequencing)足見其劃時(shí)代的改變,同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能,所以又被稱為深度測(cè)序(deepsequencing).高通量測(cè)序平臺(tái)的代表是羅氏公司(Roche)的454測(cè)序儀(RochGSFLXsequencer),Illumina公司的Solexa基因組分析儀(IlluminaGenomeAnalyzer)和ABI的SOLiD測(cè)序儀(ABISOLiDsequencer).2008年4月HelicoBioScience公司的Timothy等人在Science上報(bào)道了他們開發(fā)的真正的單分子測(cè)序技術(shù),并利用該技術(shù)對(duì)一個(gè)M13病毒基因組進(jìn)行重測(cè)序.這項(xiàng)技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測(cè)序,是因?yàn)樗耆邕^了上述3種高通量測(cè)序依賴的基于PCR擴(kuò)增的信號(hào)放大過程,真正達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力,向1000美元測(cè)定一個(gè)人類基因組的目標(biāo)邁出了一大步.這些平臺(tái)共同的特點(diǎn)是極高的測(cè)序通量,相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序的96道毛細(xì)管測(cè)序,高通量測(cè)序一次實(shí)驗(yàn)可以讀取40萬到400萬條序列.讀取長度根據(jù)平臺(tái)不同從25堿基到450堿基,不同的測(cè)序平臺(tái)在一次實(shí)驗(yàn)中,可以讀取1G到14G不等的堿基數(shù),這樣龐大的測(cè)序能力是傳統(tǒng)測(cè)序儀所不能比擬的.4轉(zhuǎn)錄組mrna的表達(dá)及與chip-chp、dna-蛋白相互作用的研究高通量測(cè)序可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實(shí)驗(yàn)步驟,避免了亞克隆過程中引入的偏差.依靠后期強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力,對(duì)照一個(gè)參比基因組(referencegenome)高通量測(cè)序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測(cè)序(re-sequence),2007年vanOrsouw等人結(jié)合改進(jìn)的AFLP技術(shù)和454測(cè)序技術(shù)對(duì)玉米基因組進(jìn)行了重測(cè)序,該重測(cè)序?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)的超過75%的SNP位點(diǎn)能夠用SNPWave技術(shù)驗(yàn)證,提供了一條對(duì)復(fù)雜基因組特別是含有高度重復(fù)序列的植物基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的技術(shù)路線.2008年Hillier對(duì)線蟲CB4858品系進(jìn)行Solexa重測(cè)序,尋找線蟲基因組中的SNP位點(diǎn)和單位點(diǎn)的缺失或擴(kuò)增.但是也應(yīng)該看到,由于高通量測(cè)序讀取長度的限制,使其在對(duì)未知基因組進(jìn)行從頭測(cè)序(denovosequencing)的應(yīng)用受到限制,這部分工作仍然需要傳統(tǒng)測(cè)序(讀取長度達(dá)到850堿基)的協(xié)助.但是這并不影響高通量測(cè)序技術(shù)在全基因組mRNA表達(dá)譜,microRNA表達(dá)譜,ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的應(yīng)用.2008年Mortazavi等人對(duì)小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進(jìn)行了RNA深度測(cè)序,這項(xiàng)工作展示了深度測(cè)序在轉(zhuǎn)錄組研究上的兩大進(jìn)展,表達(dá)計(jì)數(shù)和序列分析.對(duì)測(cè)得的每條序列進(jìn)行計(jì)數(shù)獲得每個(gè)特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量,是一種數(shù)碼化的表達(dá)譜檢測(cè),能檢測(cè)到豐度非常低的轉(zhuǎn)錄本.分析測(cè)得的序列,有大于90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中,而那些在已知序列之外的信息通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報(bào)道過的RNA剪切形式,3′末端非翻譯區(qū),變動(dòng)的啟動(dòng)子區(qū)域以及潛在的小RNA前體,發(fā)現(xiàn)至少有3500個(gè)基因擁有不止一種剪切形式.而這些信息無論使用芯片技術(shù)還是SAGE文庫測(cè)序都是無法被發(fā)現(xiàn)的.同年Sugarbaker利用mRNA深度測(cè)序?qū)盒孕啬ち龊蛯?duì)照樣品進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)了腫瘤中存在的15個(gè)不同的點(diǎn)突變.高通量測(cè)序另一個(gè)被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究.測(cè)序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測(cè)小分子時(shí)遇到的技術(shù)難題(短序列,高度同源),而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測(cè)序的長度,使得數(shù)據(jù)“不浪費(fèi)”,同時(shí)測(cè)序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA.在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經(jīng)成功地找到了新的小分子RNA.在線蟲中獲得了40萬個(gè)序列,通過分析發(fā)現(xiàn)了18個(gè)新的小RNA分子和一類全新的小分子RNA,通過對(duì)人胚胎干細(xì)胞發(fā)育前后的分析,獲得了334個(gè)小RNA的表達(dá)譜帶,包括新發(fā)現(xiàn)的104個(gè)小RNA.在DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究上,染色質(zhì)免疫沉淀-深度測(cè)序(ChIP-seq)實(shí)驗(yàn)也展示了其非常大的潛力.染色質(zhì)免疫沉淀以后的DNA直接進(jìn)行測(cè)序,對(duì)比refseq可以直接獲得蛋白與DNA結(jié)合的位點(diǎn)信息,相比ChIP-chip,ChIP-seq可以檢測(cè)更小的結(jié)合區(qū)段、未知的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段.2007年Johnson等人用ChIP-seq對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NRSF在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了全基因組的篩查,獲得了1946個(gè)結(jié)合位點(diǎn),最小能分辨的結(jié)合位點(diǎn)為50個(gè)堿基,這些高質(zhì)量的ChIP-seq結(jié)果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的內(nèi)容,其中包括了胰島發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要轉(zhuǎn)錄因子.同年Robertson等人用同樣的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子和基因組DNA的結(jié)合情況.這兩項(xiàng)研究同時(shí)驗(yàn)證了以往用ChIP-chip實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)發(fā)現(xiàn)新的結(jié)合位點(diǎn),Robertson等人發(fā)現(xiàn),ChIP-seq的分辨率可達(dá)40堿基.2008年Chen等人在Cell上發(fā)表論文,用ChIP-seq檢測(cè)了Nanog,Oct4,STAT3,Smad1,Sox2等13個(gè)序列特異性的轉(zhuǎn)錄因子與基因組DNA的結(jié)合情況,這些轉(zhuǎn)錄因子都是LIF和BMP途徑的重要調(diào)控分子.這些轉(zhuǎn)錄因子在ES細(xì)胞里結(jié)合位點(diǎn)為我們揭示了ES細(xì)胞內(nèi)決定ES細(xì)胞發(fā)育方向的調(diào)控網(wǎng)絡(luò).5芯片和深度測(cè)序高通量測(cè)序技術(shù)雖然建立的時(shí)間不長,但是在基因組的各個(gè)研究領(lǐng)域都顯示出其非凡的魅力,而且日益顯示出其對(duì)基因芯片“取而代之”的咄咄態(tài)勢(shì).那么,基因芯片向何處去呢?基因芯片技術(shù)經(jīng)過近15年的發(fā)展已經(jīng)形成了一個(gè)系統(tǒng)的平臺(tái),從樣品制備、芯片制作、芯片雜交、數(shù)據(jù)掃描到后期的數(shù)據(jù)管理,儲(chǔ)存以及深度數(shù)據(jù)挖掘都有了標(biāo)準(zhǔn)化的流程、堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)的支持,成為一個(gè)非常穩(wěn)定可信的實(shí)驗(yàn)技術(shù),為廣大的研究者所運(yùn)用,同時(shí)也積累了龐大的公共數(shù)據(jù)庫.深度測(cè)序要建立這