加味四逆散對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠血漿和下丘腦da、5-h、e、ne的影響

加味四逆散對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠血漿和下丘腦da、5-h、e、ne的影響

近年來(lái)，不同形式的適應(yīng)者影響著人們的生活質(zhì)量，而慢性心理適應(yīng)者對(duì)身體的心身傷害越來(lái)越受到重視。我們采用束縛限制活動(dòng)空間的方法造成慢性心理應(yīng)激大鼠模型,觀察應(yīng)激大鼠血漿和下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化以及調(diào)肝、補(bǔ)腎、健脾治法對(duì)其的影響,并在此基礎(chǔ)上,比較不同治法方藥的治療效應(yīng)?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。中藥、試劑及實(shí)驗(yàn)方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組Wistar大鼠,雌雄各半,體重180～220g,由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠正常飲食,在光-暗周期為12h,溫度(20±2)℃,安靜環(huán)境下飼養(yǎng)7天。按體重隨機(jī)分為6組(每組10只):對(duì)照組(簡(jiǎn)稱C),不給任何刺激。模型組(簡(jiǎn)稱M),給予束縛制動(dòng)刺激,不予中藥。調(diào)肝中藥組(簡(jiǎn)稱C1),束縛制動(dòng)刺激前給予加味四逆散。人參總皂甙組(簡(jiǎn)稱C2),束縛制動(dòng)刺激前給予人參總皂甙。補(bǔ)腎中藥組(簡(jiǎn)稱C3),束縛制動(dòng)刺激前給予腎氣丸。健脾中藥組(簡(jiǎn)稱C4),束縛制動(dòng)刺激前給予四君子湯。2藥物加味四逆散組成及劑量:柴胡5g白芍15g枳殼6g枸杞子15g山梔子5g干地黃18g石決明30g。腎氣丸組成及劑量:干地黃30g淮山藥15g山茱萸15g澤瀉10g茯苓10g牡丹皮10g桂枝4g附子4g。四君子湯組成及劑量:黨參20g白術(shù)15g茯苓15g炙甘草6g。以上中藥由本校第一附屬醫(yī)院藥房提供,經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材,按成年人70kg體重劑量的10倍分別水煎濃縮至含生藥1.35g/ml、1.4g/ml、0.8g/ml,高壓滅菌,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。人參總皂甙由長(zhǎng)春白求恩醫(yī)科大學(xué)提供,配制成水溶液7mg/ml。3試劑及儀器去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)標(biāo)準(zhǔn)品均為Sigma公司產(chǎn)品。緩沖液:3mmol/L庚烷磺酸鈉,100mmol/L醋酸鈉,85mmol/L檸檬酸,0.2mmol/LEDTA。緩沖液調(diào)至pH為4.0。高效液相色譜儀為Waters公司510高壓泵(美國(guó)),7125進(jìn)樣器,HP1049A電化學(xué)檢測(cè)器,HiqsilC18色譜柱(日本)。4.6mm×150mm粒度5μm。流動(dòng)相:緩沖液:甲醇=90:10(v/v)。檢測(cè)器電極:玻璃碳電極。檢測(cè)電壓:0.7V。高壓泵流速:1ml/minN2000色譜數(shù)據(jù)工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所提供)。4實(shí)驗(yàn)方法4.1慢性心理應(yīng)激反應(yīng)模型的制作將造模大鼠置于自制的束縛制動(dòng)筒內(nèi)(由大鼠固定儀改制而成),通過移動(dòng)插片而逐步縮小大鼠的活動(dòng)空間,調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的緊張程度,每日束縛制動(dòng)1次,每日開始時(shí)間及束縛制動(dòng)時(shí)間不同,第1天為4h,其后每次增加30～60min,連續(xù)2周。造模大鼠在制動(dòng)期間禁食、禁水。造模結(jié)束后在動(dòng)物清醒、安靜狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.2給藥方法C1、C2、C3、C4組分別在束縛制動(dòng)刺激前給予加味四逆散、人參總皂甙、腎氣丸及四君子湯各2ml灌胃,C組及M組以等量生理鹽水灌服。各組動(dòng)物均于造模前1h給藥,1h后將M組、C1組、C2組、C3組、C4組大鼠分別置于束縛制動(dòng)筒內(nèi)開始造模。4.3檢測(cè)項(xiàng)目及方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷頭取血,4℃放置4h,4000r/min,4℃離心15min,取上清,加入等體積的0.1mol/L高氯酸(內(nèi)含0.1%半胱氨酸),振搖混合30s(渦流振蕩器),再加一滴濃高氯酸(原液),冰上振蕩1.5min,18000r/min4℃離心20min,取上清液100～200μl進(jìn)樣分析。斷頭取血的同時(shí),快速在冰盤上分離出下丘腦,電子天平稱重,冷凍,加0.1mol/L高氯酸(內(nèi)含0.1%半胱氨酸)1ml,冰浴中磨成勻漿(20ul/mg),18000r/min4℃離心20min,取上清液25～100μl進(jìn)樣分析。以樣品峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物保留時(shí)間對(duì)照定性。以DHBA為內(nèi)標(biāo)物,以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值進(jìn)行定量分析。5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示,采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。不同中藥配方對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠血漿da、ni、5-ht、ht/ni的影響1調(diào)肝、補(bǔ)腎、健脾方藥對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠血漿DA、E、NE、5-HT的影響見表1。模型組大鼠造模后血漿DA、5-HT含量明顯低于對(duì)照組(P<0.01),而NE、E含量則明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。加味四逆散能明顯升高血漿DA和5-HT含量(P<0.01),降低血漿NE和E含量(P<0.01)。人參總皂甙雖能顯著升高血漿DA含量(P<0.01),但與加味四逆散比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。人參總皂甙對(duì)于應(yīng)激大鼠血漿E、5-HT雖有調(diào)整作用,但效果不及加味四逆散,兩組比較差異有顯著性(P<0.05)。加味四逆散可明顯降低應(yīng)激大鼠血漿NE含量(P<0.01),但人參總皂甙卻上調(diào)了NE。腎氣丸雖然對(duì)4項(xiàng)單胺類遞質(zhì)含量均有升高作用,但其所升高的幅度都相當(dāng)大,并超過了對(duì)照組和模型組水平。此外,腎氣丸對(duì)升高的NE和E不但沒有降低反而升高。四君子湯對(duì)應(yīng)激大鼠血漿DA含量不但沒有升高反而降低,對(duì)血漿NE不但沒有降低反而升高,對(duì)5-HT和E的含量雖有調(diào)整作用,但與加味四逆散比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。由此可見,對(duì)于慢性心理應(yīng)激大鼠的血漿中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié),加味四逆散明顯優(yōu)于腎氣丸、四君子湯和人參總皂甙。2調(diào)肝、補(bǔ)腎、健脾方藥對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠下丘腦DA、NE、5-HT的影響見表2。造模后模型組大鼠下丘腦DA和5-HT含量明顯降低(P<0.05),NE含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。加味四逆散對(duì)應(yīng)激大鼠下丘腦中DA和5-HT含量均有明顯升高作用(P<0.01)。人參總皂甙對(duì)5-HT含量幾乎沒有影響,對(duì)DA含量雖有升高作用,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腎氣丸可明顯升高應(yīng)激大鼠下丘腦5-HT及DA含量(P<0.05),但與加味四逆散比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。腎氣丸對(duì)NE雖然有一定的調(diào)節(jié)作用,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。四君子湯對(duì)DA和NE有明顯調(diào)節(jié)作用(P<0.05),但與加味四逆散比較差異無(wú)顯著性(P>0.05);在升高5-HT方面,加味四逆散明顯優(yōu)于四君子湯。由此可見,對(duì)于中樞神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié),加味四逆散綜合調(diào)節(jié)作用明顯優(yōu)于其他3組。3調(diào)肝、補(bǔ)腎、健脾方藥對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠血漿5-HT/NE、5-HT/E及下丘腦5-HT/NE的影響見表3。模型組大鼠血漿5-HT/NE、5-HT/E及下丘腦5-HT/NE均明顯下降(均P<0.01)。加味四逆散可以升高下丘腦和血漿5-HT/NE以及血漿5-HT/E(P<0.05或P<0.01)。人參總皂甙對(duì)于血漿5-HT/NE和5-HT/E均無(wú)正向調(diào)節(jié)作用,相反卻下調(diào);對(duì)下丘腦5-HT/NE雖有升高作用,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腎氣丸雖能升高血漿和下丘腦的5-HT/NE,但與模型組比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)血漿中5-HT/E雖有下調(diào)趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。四君子湯對(duì)血漿中5-HT/E雖然有升高作用,但不如加味四逆散。此外,四君子湯對(duì)下丘腦5-HT/NE有上調(diào)趨勢(shì),但與M組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,對(duì)血漿5-HT/NE比值則有下調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)。由此可見,加味四逆散的綜合調(diào)節(jié)作用明顯優(yōu)于其他用藥3組。反復(fù)心理應(yīng)激與精神行為異常本實(shí)驗(yàn)利用自制的束縛制動(dòng)器來(lái)限制大鼠的活動(dòng)空間,同時(shí),為了避免動(dòng)物對(duì)造模方法產(chǎn)生習(xí)慣性,我們采用造模時(shí)間不固定并且每天延長(zhǎng)造模時(shí)間,從而造成慢性心理應(yīng)激反應(yīng)大鼠模型。采用高效液相電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)慢性心理應(yīng)激大鼠血漿和下丘腦中單胺類遞質(zhì)含量,我們發(fā)現(xiàn),應(yīng)激大鼠下丘腦和血漿中5-HT和DA含量均明顯降低;血漿中NE和E含量顯著升高,下丘腦NE卻幾乎無(wú)改變。5-HT在調(diào)節(jié)機(jī)體的情緒方面具有相當(dāng)重要的作用,5-HT含量減少的原因可能是在應(yīng)激狀態(tài)下,下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進(jìn),增高的皮質(zhì)酮通過誘導(dǎo)肝臟色氨酸吡咯化酶,降解血漿色氨酸,終致中樞色氨酸不足和5-HT合成低下。在本實(shí)驗(yàn)中,連續(xù)2周的反復(fù)心理應(yīng)激可使大鼠體內(nèi)5-HT長(zhǎng)期釋放,這也可以導(dǎo)致5-HT的耗竭。精神活動(dòng)異常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT和NE相互作用的關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注,特別是5-HT和NE之間的非平衡狀態(tài)與精神異常的關(guān)系已初步建立。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢性心理應(yīng)激大鼠血漿5-HT/NE、5-HT/E以及下丘腦5-HT/NE均明顯下降,說明心理應(yīng)激可使大鼠神經(jīng)遞質(zhì)間的平衡失調(diào),本實(shí)驗(yàn)方法所造成的應(yīng)激大鼠有抑郁狀態(tài)的存在。人參總皂甙雖然可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能和抗應(yīng)激能力,但對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠血漿及下丘腦5-HT的調(diào)節(jié)不如加味四逆散。腎氣丸、四君子湯對(duì)血漿5-HT、5-HT/E,血漿和下丘腦5-HT/NE的調(diào)節(jié)無(wú)規(guī)律性,基本無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DA系統(tǒng)主要參與調(diào)控精神活動(dòng)。以前有研究表明,在反復(fù)長(zhǎng)期遭受心理應(yīng)激的情況下,大量的DA被耗竭,最終導(dǎo)致其含量明顯下降,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。NE、E均參與應(yīng)激反應(yīng),并反映出一定的情緒狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿NE、E明顯升高,這與交感神經(jīng)興奮有關(guān),但中樞NE含量卻無(wú)明顯變化,這似乎說明限制大鼠空間活動(dòng)范圍這種應(yīng)激方法不會(huì)刺激中樞產(chǎn)生更多的NE,但這尚需要作進(jìn)一步研究。此外,由于E在中樞的含量很微小,而且限于實(shí)驗(yàn)條件,本次實(shí)驗(yàn)沒有檢測(cè)到。加味四逆散可顯著降低血漿NE和E,從而對(duì)交感神經(jīng)功能亢進(jìn)有良好的調(diào)整作用,由此,對(duì)應(yīng)激大鼠的不良情緒變化亦有積極的調(diào)節(jié)作用。人參皂甙對(duì)應(yīng)激大鼠血漿中升高的NE非但沒有降低,反而進(jìn)一步升高,其機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。腎氣丸對(duì)本實(shí)驗(yàn)方法所造成的心理應(yīng)激大鼠的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代