生物活性肽分離純化的研究進展

生物活性肽分離純化的研究進展

0生物活性肽的功能活性物質(zhì)的定義是：對身體的功能和狀態(tài)有積極影響，并可能暫時影響身體健康的特定蛋白質(zhì)片段。它是溝通細(xì)胞與細(xì)胞之間、器官與器官之間的重要化學(xué)信使,通過內(nèi)分泌、旁分泌、神經(jīng)內(nèi)分泌以及神經(jīng)分泌等作用方式,傳遞各種特異信息,是由機體構(gòu)成的一系列嚴(yán)密控制系統(tǒng),從而可調(diào)節(jié)生長、發(fā)育、繁殖、代謝和行為等生命過程。對生物活性肽的研究,甚至涉及人類的意識、行為、學(xué)習(xí)和記憶等更高層次的生命形態(tài)和活動規(guī)律,涉及免疫防御、腫瘤病變、延緩衰老、生殖控制和生物鐘節(jié)律等一系列理論和實際問題,因而具有重要的理論意義和實踐意義。生物活性肽以其生理功效明顯、來源豐富、安全性高、可被開發(fā)為功能食品、醫(yī)藥及化妝品等具有高附加值的生物制品。多肽廣泛存在于自然界的動物、植物和微生物等之中,來源豐富,原料組成復(fù)雜,它的分離、純化已成了一個研究熱點。近年來有關(guān)多肽的分離純化方法很多,主要有高效液相色譜(HPLC)法、超濾法、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法等。本文簡要介紹了這些方法的基本原理,綜述了近年來多肽分離純化的研究熱點,探討了其今后的發(fā)展趨勢。1分離純度方法的研究1.1高效液相色譜法高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上,引用了氣相色譜的理論,流動相以高壓輸送,色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成,從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜,同時柱后連有高靈敏度的檢測器,可對流出物進行連續(xù)檢測。高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。它以分離效果好、速度快、樣品容量大、靈敏度高和回收率高的特點,而成為生物活性多肽的主要分離純化方法。該法應(yīng)用于生物活性多肽的分離純化研究中,目前主要應(yīng)用于酶解工程,基因工程等領(lǐng)域。趙駿等以酪蛋白為原料,采用微生物蛋白酶A水解,其酶解產(chǎn)物為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)。實驗采用DA201-C型大孔樹脂脫鹽,樣品脫鹽率達到85%以上,ACE抑制率提高1倍,并用SephadexG-15(層析柱規(guī)格1.6×85cmI.D.)對脫鹽后產(chǎn)物分離純化,洗脫液為0.02moL/L醋酸緩沖液,反相高效液相色譜(色譜柱μBondapakC183.9×300mmI.D.和μBondapakC1819×300mmI.D.)在以流動相A梯度洗脫的條件下對產(chǎn)物進一步分離純化,經(jīng)純度分析,最終得到單一純品,其體外ACE抑制率達到84.4%和79.6%。吳亞麗等利用高效液相色譜法分析降血壓肽AHP的最佳工藝條件。實驗結(jié)果表明:RP-HPLC分離AHP的優(yōu)化后條件有兩個,都可實現(xiàn)完全分離。①ACN濃度12%(v/v),TFA濃度0.03%(v/v),洗脫速度0.8mL/min,保留時間為10.30min。②ACN濃度12%(v/v),TFA濃度0.05%(v/v),洗脫速度1.0mL/min,保留時間為11.41min。高效液相色譜分析條件的優(yōu)化,有利于AHP的檢測和分析,也為該法在活性多肽的分離純化研究提供了一定的實踐經(jīng)驗。HPLC是19世紀(jì)60年代末發(fā)展起來的新型分離分析技術(shù),它分離效果好、分辨率高、分析速度快,為肽類物質(zhì)的分離、鑒定和純化合成等提供了有利手段。近年來,HPLC被證明不僅可進行分析,而且還可以進行克量肽的制備。1.2膜的濃縮效果超濾是一種加壓膜分離技術(shù),即在一定的壓力下,小分子溶質(zhì)和溶劑能穿過一定孔徑特制的薄膜,大分子溶質(zhì)滯留,從而使大分子物質(zhì)得到部分的純化。超濾自20世紀(jì)20年代問世后,已成為一種重要的分離試驗技術(shù),廣泛用于含有小分子溶質(zhì)的各種生物大分子的濃縮、分離和純化。此技術(shù)的優(yōu)點是操作簡便,成本低廉,不需增加任何化學(xué)試劑。尤其是超濾技術(shù)的試驗條件溫和,不需加熱,與蒸發(fā)和冰凍干燥相比沒有相的變化,而且不易引起溫度、pH值的變化,因而可以防止生物活性物質(zhì)如酶的變性、失活和自溶等。袁國棟等采用超濾技術(shù)從ε-聚賴氨酸(ε-PL)粗品溶液中純化ε-PL,研究了超濾過程中的操作壓力、操作溫度、超濾液的體積和料液初始濃度等因素對膜通量和粗品溶液中蛋白截留率及ε-PL透過率的影響,并確立了采用聚砜膜去除ε-PL粗品溶液中蛋白工藝的最佳參數(shù),在此條件下,蛋白去除率達到86.2%,ε-PL透過率達到86.7%。劉成梅等采用超濾技術(shù)分離羅非魚魚皮蛋白酶解液(TSP-I),研究了超濾壓力、時間和濃度對膜滲透通量、滲透增量和膜效能的影響。結(jié)果表明:超濾處理的壓力為28Psi、時間為40min、濃度為5%的操作條件下,膜滲透通量為9.98LHM,滲透增量為2.68g/10min,膜效能為3.41g/m2·min,超濾處理達最佳效果。近年來,超濾技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于大豆多肽的分離純化,大大提高了大豆多肽的品質(zhì)。但是超濾膜在使用過程中的一個主要問題是由于濃差極化、膜孔堵塞及凝膠層出現(xiàn)等因素的影響,導(dǎo)致膜通量隨運行時間的延長而降低,因此正確掌握和執(zhí)行操作參數(shù)對超濾系統(tǒng)的長期、安全、穩(wěn)定運行以及提高產(chǎn)物得率是極為重要的。目前超濾方法研究工作主要集中在膜材料選取方面。超濾法以其大量制備的優(yōu)勢已發(fā)展成為實驗室和工業(yè)生產(chǎn)上分離分析及制備生物大分子的最有效和常用的方法。1.3cec與氨基酸衍生物的分離HPCE是20世紀(jì)60年代末由Hjerten在傳統(tǒng)的電泳技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)明的,它利用小的毛細(xì)管代替?zhèn)鹘y(tǒng)的大電泳槽,使電泳效率提高了幾十倍。此技術(shù)在20世紀(jì)80年代得到迅猛地發(fā)展,是生物化學(xué)分析工作者與生化學(xué)家分離、定性多肽與蛋白類物質(zhì)的有利工具。程燕等以咔唑-9-乙基氯甲酸酯(CEOC)作為柱前衍生試劑,在膠束電動色譜模式下對16種二肽進行了分離,研究了用該試劑衍生的二肽物分離的幾個關(guān)鍵的條件,在14min內(nèi)實現(xiàn)了16種CEOC二肽衍生物的分離。EliZahou等采用毛細(xì)管電泳技術(shù)對蛋白質(zhì)水解物中的多肽進行分離純化研究,該法采用異硫氰酸苯酯衍生并在磷酸緩沖液中加入SDS來提高分離度,縮短分離時間,且苯基硫代氮甲酰衍生物的檢測在一定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)為0.9938,遷移時間和峰面積的變化平均在1.1%~2.7%之間。研究表明,對10~600個氨基酸殘基的多肽,該方法的靈敏度比HPLC高20倍,而比傳統(tǒng)的基于茚三酮的方法則高1000倍。此外,SigridC.等用毛細(xì)管電泳對谷氨?；募八鼈兊慕到馕锖彤悩?gòu)體進行了分離。Ye等以強陽離子交換填料為固定相的IE-CEC分離小分子肽。Fu等用親水離子CEC分離了小分子肽的。作為一種迅猛發(fā)展起來的新分離分析技術(shù),HPCE以其高效、快速和低實驗消耗等優(yōu)點,受到了廣泛重視,在藥物分析、食品安全監(jiān)測和生命科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。1.4cec分離及其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)毛細(xì)管電色譜(CEC)是近10年來綜合了現(xiàn)代最新分離技術(shù)HPLC和毛細(xì)管電泳(CE)的優(yōu)勢而發(fā)展起來的一種高效、快速的新型微柱分離方法。它有機地結(jié)合了HPLC的多選擇性和CE的高效性,已越來越多地用于手性物質(zhì)的研究。毛細(xì)管電色譜法(CEC)是在毛細(xì)管中填充或在毛細(xì)管壁涂布、鍵合色譜固定相,用電滲流或電滲流結(jié)合壓力流來推動流動相的一種液相色譜法,它克服了毛細(xì)管電泳(CE)對電中性物質(zhì)難分離的缺點,并且結(jié)合了液相色譜固定相和流動相選擇性多的優(yōu)點,是高效液相色譜法和高效毛細(xì)管電泳的有機結(jié)合。Walhagen等早期用HypersilC8、C18混合模式以及SpherisorbC18/SC柱(0.100×250mm),以乙氰-三乙胺-磷酸(pH值3)為流動相,研究了CEC分離堿性、中性和酸性多肽的選擇性和保留行為,其結(jié)果與CZE和RP-HPLC的結(jié)果完全不同。后來walhagen等又以各種不同的N-烷基硅膠反相吸附劑作為固定相,以及混合模式固定相(同時將強陽離子交換基團和N-烷基鍵合到硅膠表面),以不同pH值的流動相,考察了激素類的線型或環(huán)狀的活性肽如:enkephalin、angiotensin、desmopressin、earbetoein和xytocin的保留行為。MingliangYe等應(yīng)用強陽離子交換填充物做固定相的離子交換毛細(xì)管電色譜(IE-CEC)對肽的分離進行了研究。實驗中的理論板數(shù)達到240000~460000板/m,且連續(xù)10次測定,遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)差小于0.27%,應(yīng)用IE-CEC可以在3.5min內(nèi)對10種肽進行快速分離。KaiZhang等則采用加壓毛細(xì)管電色譜對多肽進行分離。進行連續(xù)梯度洗脫,流動相受壓力和電滲的共同驅(qū)使,在分離復(fù)雜樣品時比等度壓力毛細(xì)管電色譜具有更好的效果。CEC作為一種新型的分離分析方法,兼有高效、多選擇性、用量少、峰容量大、比HPLC更易與MS聯(lián)用等優(yōu)點。近年來CEC分離的研究迅速增多,但國內(nèi)學(xué)者對CEC法分離純化多肽的研究不是很多且技術(shù)不夠成熟,有待于科研工作者今后不懈的努力。1.5bmp分離純化隨著科學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,生物制品的分離純化技術(shù)已成為生物技術(shù)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。采取何種方法分離純化多肽物質(zhì)要根據(jù)分離的多肽物質(zhì)性質(zhì)的不同,采用不同的分離手段。當(dāng)某一種分離純化方法不能滿足人們對樣品純度和制備量的要求時,就應(yīng)該將幾種分離分析方法結(jié)合使用。以下為幾種聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用實例。楊超等使用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對重組酵母發(fā)酵液中一種牛肉風(fēng)味肽(BMP)進行了分離純化和穩(wěn)定性研究。該研究分別運用D301離子交換層析和SephadexG-25凝膠過濾層析對其進行了分離純化,利用RP-HPLC對目標(biāo)肽進行分析檢測。分離純化結(jié)果顯示,SephadexG-25凝膠過濾層析的分離純化效果優(yōu)于D301離子交換層析,更適合于分離復(fù)雜體系發(fā)酵液中的風(fēng)味肽。劉璇等利用凝膠過濾層析SephadexG-75和強陽離子交換色譜SP-650M相結(jié)合,從苦瓜籽中分離純化出一種活性多肽。該多肽在Tricine-SDS上顯示為單一的譜帶,分子量約為6.8kDa.在經(jīng)還原劑二硫蘇糖醇(DTT)處理后的電泳結(jié)果表明該多肽不含有分子間的二硫鍵。此多肽是一種胰蛋白酶抑制劑,同時具有抗植物致病菌活性,是一種具有雙功能作用的多肽。目前,多種類型分離純化技術(shù)在生化產(chǎn)品應(yīng)用中協(xié)同發(fā)展,技術(shù)聯(lián)用,取長補短,實行多級分離是生物活性多肽分離純化的發(fā)展趨勢。可以預(yù)見,在不久的將來,會建立一套完整的多肽類物質(zhì)的分離和提純技術(shù),并且這一技術(shù)會向快速、靈敏及高自動化方向發(fā)展,以滿足科研及生產(chǎn)的需要。2生物活性多肽的發(fā)展趨勢隨著生命科學(xué)的發(fā)展,生物制品的分離純化技術(shù)已成為生物技術(shù)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵,尤其是對推動我國多肽類保健食品和藥品的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。目前這方面的研究十分活躍,且不斷向縱深方向發(fā)展。各種新的分析方法、分離技術(shù)以及聯(lián)用技術(shù)將大大推動其研究進展,攻破了許多懸而未決的難題