海洋活性多肽的研究進(jìn)展

海洋活性多肽的研究進(jìn)展

海洋生物活性物質(zhì)是現(xiàn)代生物學(xué)的熱點(diǎn)，自然?；钚晕镔|(zhì)是海洋活動(dòng)物質(zhì)研究的重要組成部分。由于海洋生物的生活環(huán)境與陸地生物迥異,海洋生物具有多樣性、復(fù)雜性和特殊性,從而使源于其中的海洋天然產(chǎn)物與陸地天然產(chǎn)物不同,這為尋找新的天然活性物質(zhì)提供了豐富的物質(zhì)來源。生物活性多肽是具有特殊生理活性的肽類,按其來源可分為天然存在的活性肽、蛋白酶解活性肽以及化學(xué)合成的活性肽。自1902年,倫敦大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Bayliss和Starling第一次發(fā)現(xiàn)活性多肽物質(zhì)——促胰液素(secretin)以來,人們對(duì)多肽的研究逐漸深入,并且發(fā)現(xiàn)了數(shù)萬種的生物活性多肽,其中有近百種多肽作為藥物進(jìn)行生產(chǎn)。為人類抵御疾病作出了重大貢獻(xiàn)。從目前研究的情況來看,海洋天然活性多肽的研究主要集中在海綿、芋螺、海葵、海藻等少數(shù)幾種海洋生物中。作用也十分明確:抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等。盡管大量的活性多肽已經(jīng)從海洋生物中分離得到,但其中僅有少部分可作為藥品進(jìn)行開發(fā)進(jìn)入市場(chǎng),相當(dāng)多的新化合物作為先導(dǎo)化合物,為新藥的研究提供線索;還有一些海洋活性多肽在生物體內(nèi)的含量很少,所以在其生理活性和結(jié)構(gòu)確定后,采用全合成和固相合成的技術(shù)實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本文就近年來海洋活性多肽的研究進(jìn)展作一綜述。1活性肽的分離和合成近年來,許多科學(xué)家致力于從深海細(xì)菌、真菌、微藻以及海洋軟體動(dòng)物中分離活性肽,并且取得了很大進(jìn)展。這些活性肽結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣,參與生物體的重要生命活動(dòng),具有重要的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用價(jià)值,是一類非常重要的新藥來源。1.1抗結(jié)核桿菌活性的比較有些生物體在受到外界環(huán)境刺激時(shí)產(chǎn)生大量具有抗菌活性的陽離子多肽,從而使其具有天然免疫力。目前,已有百余種抗菌肽被分離,有些抗菌肽不僅具有很強(qiáng)的殺菌能力,還能殺死腫瘤細(xì)胞。這些海洋多肽類化合物的發(fā)現(xiàn)為尋找新的抗生素提供了線索。1996年,Hamann,M.T.等報(bào)道了從SacoglossanMulluskElysiarufescens。與KahalalideF不同,KahalalideA(圖2)則未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性,但是該化合物具有極強(qiáng)的抗結(jié)核桿菌的活性,在濃度為12μg·mL-1時(shí),對(duì)結(jié)核桿菌M.tuberculosis(H37Rv)的抑制率為83%,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)具有抗結(jié)核桿菌的活性的海洋活性多肽,值得進(jìn)一步研究。1997年,Gerard,J.等報(bào)道了2種環(huán)狀縮醛肽:MassetolideA和Viscosin,二者都有很強(qiáng)的抗結(jié)核桿菌的活性。前者是從海洋微藻中分離的假單胞桿菌屬菌株中提取得到的,最小抑菌濃度MIC為2.5～5μg·mL-1,后者是從1種管狀蠕蟲中分離得到,最小抑菌濃度MIC為5～10μg·mL-1。2001年,ToddBarsby等從新幾內(nèi)亞海洋微生物枯草桿菌屬的菌株中分離得到1種多肽類的抗生素BogorolA,該化合物能夠?qū)θf古霉素耐藥腸道球菌(VRE)和青霉素耐藥金黃色葡萄球菌(MRSE)產(chǎn)生抵抗作用。1.2laxaphicinsa和依代爾的細(xì)胞毒性研究許多存在于海洋生物體內(nèi)的化合物具有顯著的細(xì)胞活性,為尋找抗腫瘤藥物開辟了新途徑。1987年,Pettit等首次從海兔(Dolabellaauricularia)體內(nèi)分離得到由4個(gè)氨基酸組成的線性小肽Dolastatin-10,該化合物通過抑制微管聚合,對(duì)人乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌有顯著療效,具有良好的前景。目前,美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(NCI)與基諾藥廠(Knoll)合作,該藥正進(jìn)入臨床I期研究階段。近幾年,Dolastatin-10的結(jié)構(gòu)類似物DolastatinH和IsodolastatinH相繼被發(fā)現(xiàn),并且也顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。1997年,IsabelleBonnard等從海洋絲狀藻青菌(Lyngbyamajuscula)中分離得到一系列具有細(xì)胞毒性和抗菌活性的環(huán)狀脂肽,其中最主要的2種化合物L(fēng)axaphycinsA和B都具有非同一般的抗真菌和細(xì)胞毒性的生物協(xié)同作用,藥理實(shí)驗(yàn)表明,LaxaphycinsA單獨(dú)用藥對(duì)細(xì)胞株的作用不大,幾乎無活性,而LaxaphycinsA能夠潛在地提高LaxaphycinsB的活性,加入1μmol/L的LaxaphycinsA,LaxaphycinsB對(duì)人體淋巴母細(xì)胞的IC50值降低3倍。表1列舉了目前制藥公司、癌癥研究所及多所大學(xué),正在研究的多種從海洋生物提取的抗癌化學(xué)成分,其中一些很有希望成為藥物。1.3papuamicasid的海洋活性多肽1999年,PaulW,Ford等從新幾內(nèi)亞海域采集的海綿(TheonellamirabilisandTheonellaswinhoei)分離得到4種新化合物PapuamidesA,B,C,D,均為環(huán)狀縮醛肽,并且是首次發(fā)現(xiàn)分子結(jié)構(gòu)中含有3-羥基亮氨酸和同型脯氨酸殘基的海洋活性多肽。PapuamidesA,B能夠抑制體內(nèi)由HIV-ⅠRF引起的T-淋巴細(xì)胞感染,在體外的有效濃度EC50為3.6ng.mL-1,PapuamidesA對(duì)癌細(xì)胞也具有細(xì)胞毒性,其IC50為75ng.mL-1。2001年,MohammadA.Rashid.等從印度尼西亞海綿(Sidonopsmicrospinosa)中分離得到一種新型的環(huán)狀縮醛肽Microspisamide,由13個(gè)氨基酸殘基組成,其中含有一個(gè)β-OH-BrPhe殘基,這是以前所發(fā)現(xiàn)的海洋多肽中從未見過的。該化合物能夠抑制由HIV-Ⅰ感染引起的細(xì)胞病變。1.4關(guān)于芋螺毒素的結(jié)構(gòu)海洋生物中存在種類眾多的肽類毒素,這些毒素性質(zhì)獨(dú)特,在生物醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)的研究和應(yīng)用方面有廣闊的前景。目前研究較多的有芋螺毒素、?？舅?其它的海洋生物毒素如水母毒素、章魚毒素、海膽毒素、海蛇毒素、海兔毒素、微囊藻素等報(bào)道的較少。芋螺毒素(ConotoxinCTX)是一類有10～30余個(gè)氨基酸殘基組成的小肽,含有2對(duì)或3對(duì)二硫鍵,是迄今發(fā)現(xiàn)的最小核酸編碼的動(dòng)物神經(jīng)肽毒素。芋螺毒素結(jié)合在神經(jīng)和肌肉的受體上,具有高親和力和高度專一的特點(diǎn),是神經(jīng)科學(xué)十分有效的探針。臨床上用作特異診斷試劑,作為鎮(zhèn)痛藥具有療效確切、不成癮的特點(diǎn)。多種芋螺毒素已申請(qǐng)國(guó)家專利。1998年,England等從地紋芋螺(Conusgeographus)中分離得到δ-CTXGVⅢA,它是富含Gly和Thr的41肽,是迄今發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素中分子最大的一個(gè)。進(jìn)一步的研究表明第34位為極為罕見的L-6-Br-色氨酸,是該毒素的功能決定因子。?？舅?AnthoplerintoxinAP)也是研究的熱點(diǎn),是一類分子量范圍為3000～6000,由2～3個(gè)二硫鍵交聯(lián)著的單鏈堿性分子,其一級(jí)結(jié)構(gòu)可分為3種類型。但以后分離出來的calitoxin,BTTXⅡ和AEXⅡ,AEXⅢ與經(jīng)典的3種類型有較大不同,代表著新穎結(jié)構(gòu)類型的?？舅囟嚯?。?？舅刂饕禺惤Y(jié)合在心臟Na+通道上,是一類非常有價(jià)值的鈉通道研究工具藥。1.5激肽釋放酶功能1997年,GaryP.Richards等黑海魚(Centropristisstriata)骨骼肌纖維中分離得到一種魚類激肽釋放酶原Prokallikrein。激肽釋放酶kallikreins在魚體內(nèi)有多種功能,首先它能夠促使酶激活荷爾蒙和生長(zhǎng)因子而調(diào)節(jié)魚的生長(zhǎng)發(fā)育;再次它能夠分裂激肽源底物釋放出激肽,而激肽通過放松血管平滑肌,增加血管緊張素,提高血管通透因子的活性來調(diào)整血壓,同時(shí)激肽能夠增強(qiáng)魚類精子活力。所以激肽釋放酶原Prokallikrein的發(fā)現(xiàn)為研究激肽釋放酶kallikreins對(duì)魚類健康和疾病的影響提供了新的研究思路。2魚類蛋白質(zhì)資源的優(yōu)化利用及酶活性多肽的使用天然存在的海洋活性多肽由于在生物體中含量低,而且提取困難,難以實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)供給所需,化學(xué)人工合成多肽成本昂貴。所以,人們更多地把目光投向開發(fā)蛋白酶解產(chǎn)物獲得活性多肽這條途徑上來。由于海洋生物生存的環(huán)境與陸地生物完全不同,如高壓、低溫、高溫和高鹽等極端環(huán)境,為了適應(yīng)這些極端的海洋生物環(huán)境,海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同,同時(shí),海洋生物蛋白資源無論在種類和數(shù)量上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陸地蛋白資源,并且未得到很好的開發(fā)。種類繁多的海洋蛋白氨基酸序列中,潛在著許多具有生物活性的氨基酸序列,用特異的蛋白酶水解,就釋放出有活性的肽段。海洋生物蛋白資源是21世紀(jì)人類重要的蛋白類食物及生物活性物質(zhì)的重要來源。我國(guó)目前的海洋生物蛋白資源總量在世界各國(guó)名列前茅,但我國(guó)目前的蛋白類水產(chǎn)品中,除一部分直接食用外,大部分通過簡(jiǎn)單的加工技術(shù)制成食品進(jìn)入市場(chǎng),加工技術(shù)落后,產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一,產(chǎn)品的附加值低,使得產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力較差。因此,我國(guó)急需對(duì)海洋生物蛋白資源進(jìn)行優(yōu)化利用和高值化加工。1979年,Oshima等首次報(bào)道了利用細(xì)菌膠原酶水解凝膠并從其水解物中分離出6種降血壓肽,此后,利用酶工程技術(shù),從其它食品蛋白質(zhì)中分離的降血壓肽相繼出現(xiàn),這些肽在體外有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性,在體外有明顯的降血壓作用。近年來,從海洋魚類及其它水產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的降壓肽見表2。在天然降血壓肽的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究中,一般認(rèn)為若肽C末端是Pro,Phe,Tyr或序列中含有疏水氨基酸則有較高活性。對(duì)于二肽,若N末端為甘氨酸殘基時(shí),其對(duì)ACE的抑制作用可因C末端不同而相差300倍,C末端為Tyr,Trp,Pro則有較強(qiáng)的抑制作用。若C末端為甘氨酸殘基時(shí),其對(duì)ACE的抑制作用可因N末端不同僅相差16倍,其中N末端為Val,Ile,Arg是最有效的。最強(qiáng)的ACE抑制二肽Val-Trp比最弱的ACE抑制二肽Pro-Gly抑制作用高10000倍。這說明ACE與底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的氨基酸殘基結(jié)合有高度的專一性。2000年,RozennRavallec-Plé等利用商品酶Alcalase○R(NovoNordisk,Nanterre,France)對(duì)鱈魚肉進(jìn)行水解,得到高品質(zhì)的魚蛋白水解物(FPHs),水解產(chǎn)物中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促分泌素(胃泌素和縮膽囊素)等。2001年,RozennRavallec-Plé等利用同一種酶Alcalase○R對(duì)加工沙丁魚的廢棄物進(jìn)行水解,得到了多種生物活性多肽:胃泌素、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。目前,大多采用陸地酶工程技術(shù)應(yīng)用于海洋蛋白酶解活性肽的研究,如中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。但是由于陸地生態(tài)環(huán)境與海洋生態(tài)環(huán)境有很大差異,海洋蛋白的氨基酸序列和組成與陸地蛋白源也存在很大差別。所以,陸地酶制劑可能無法高效用于海洋蛋白的酶解。因此,應(yīng)該從海洋生物體內(nèi)、海水及海洋污泥中分離、純化可高效酶解不同海洋蛋白的蛋白酶原。3海洋活性肽的開發(fā)目前,國(guó)內(nèi)外研究和開發(fā)的活性多肽主要來源于陸生動(dòng)植物,如從牛乳提取的具有免