《第2節(jié)土壤中分解尿素的細菌的分離與記數(shù)》

兩個主要目的：(1)從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌；(2)統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌。研究思路（1）篩選菌株（2）統(tǒng)計菌落數(shù)目（3）設置對照1、調(diào)查人的耐寒極限，到哪里找人？研究思路（一）篩選菌株2、需要培養(yǎng)具有強耐寒能力的人，該怎么培養(yǎng)？研究思路（一）篩選菌株自然界中：實驗室中：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。尿素分子的立體結構CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3脲酶分解尿素的細菌:KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1000mL①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？固體培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基1．直接計數(shù)法：最常用顯微鏡直接計數(shù)法。

（二）微生物計數(shù)：優(yōu)點：

設備簡單、能觀察微生物的形態(tài)特征。缺點：

難以計數(shù)微小量多的細菌。

無法區(qū)分死菌還是活菌。2．間接計數(shù)法：最常用稀釋涂布平板計數(shù)法。

（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目統(tǒng)計菌落數(shù)目的理論依據(jù)：當樣品的稀釋度足夠高

時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。因此，恰當?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的關鍵。注意事項：（1）選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)（2）同一稀釋度加到3個或3個以上的平板取平均值。每克樣品中的菌株數(shù)

=(C÷V)×MC：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)M：稀釋倍數(shù)

1.某同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）()

A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4練一練

統(tǒng)計的菌落往往比活菌的

實際數(shù)目低。這是因為當兩個

或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此結果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。注意：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。在對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結果。

1.第一位同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。

2.第二位同學在該濃度下涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212和256，該同學以這三個平板菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結果。實例1你認為哪位同學的結果更接近真實值？這兩位同學的實驗需要改進嗎？如果需要，如何改進？你認為哪位同學的結果更接近真實值？這兩位同學的實驗需要改進嗎？如果需要，如何改進？第一位同學只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結果不具有說服力。第二位同學考慮到設置重復組的問題，涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結果與另2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。

因此，這兩位同學的實驗需要改進，在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結果時，一定要考慮所設置的重復組的結果是否一致，結果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。說明設置重復組的重要性。三、設置對照排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。例2：在做本課題的實驗時，A同學從對應106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落。但是，其它同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。其他同學認為A同學的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或者培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導致不能分解尿素的細菌也能在該培養(yǎng)基上生長。A同學認為所選用的土壤樣品不同你能通過設置對照，幫助A同學排除上述兩個可能影響嗎？

可以由其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗結果預測：如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。方案一方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這則事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。土壤中分解尿素的細菌的分離與記數(shù)實驗設計每克樣品中的菌株數(shù)

=(C÷V)×MC：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)M：稀釋倍數(shù)

先鏟去表層土3cm左右，再取樣實驗步驟1．土壤取樣2.制備培養(yǎng)基3.樣品稀釋涂布平板4.微生物的培養(yǎng)與觀察5．菌落計數(shù)制備選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（對照）每個稀釋度均用3個選擇培養(yǎng)基和一個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基細菌在30~370C下培養(yǎng)1~2天選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果1、如何制備選擇培養(yǎng)基？為什么要制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？2、為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？因為土壤中各類微生物的數(shù)量(單位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。3、怎么鑒定選出的菌落就是分解尿素的細菌呢？挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否變紅。結果分析與評價（一）培養(yǎng)基是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否選出菌落?？瞻讓φ盏呐囵B(yǎng)基____________說明培養(yǎng)基沒有污染。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中菌落數(shù)目________選擇培養(yǎng)基中菌落數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已經(jīng)篩選出一些菌落。(二)樣品的稀釋操作是否成功如果得到了2個或2個以上的菌落數(shù)目在________的平板，說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落計數(shù)。無菌落生長小于30~300

1.某同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）()

A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4練一練

1.某同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）()

A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4練一練√

2.用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目，其結果與實際值相比

（）

A.比實際值高

B.比實際值低

C.和實際值一致

D.比實際值可能高也可能低

2.用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目，其結果與實際值相比

（）

A.比實際值高

B.比實際值低

C.和實際值一致

D.比實際值可能高也可能低√下列能選擇出分解尿素的細菌的培養(yǎng)基是A.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、