菊粉外切酶的分離、純化及水解菊粉的優(yōu)化

菊粉外切酶的分離、純化及水解菊粉的優(yōu)化

jerusal智力已經(jīng)在北美廣泛種植。它通過歐洲在亞洲和中國廣泛種植。菊芋適應(yīng)性強(qiáng),特別適合在沙漠、灘涂、鹽堿荒地等非農(nóng)業(yè)耕地種植,且產(chǎn)量高,價(jià)格低廉。菊芋塊莖菊粉含量豐富,占其鮮重15%左右,干重70%以上,菊粉(inulin)是一種生物多糖,由果糖以β-2,1-糖苷鍵連接,平均每分子中含有20-30個(gè)果糖殘基,由于含有大量果糖,可以利用產(chǎn)外切菊粉酶的微生物快速分解為果糖,再發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。國外從1950年開始發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的研究,80年代進(jìn)行了大量工作,國內(nèi)1990年也進(jìn)行一些研究,但僅限于實(shí)驗(yàn)室階段。本實(shí)驗(yàn)室保存的Kluyveromycesmarxianus是1株產(chǎn)外切型菊粉酶的菌株,筆者在研究固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件并對其進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上,采用超濾、陰離子交換色譜和凝膠過濾色譜等蛋白分離方法,研究了從K.marxianus固態(tài)發(fā)酵醪制備菊粉外切酶的方法,并對菊粉外切酶水解菊粉的條件進(jìn)行研究,為以菊芋為原料制備燃料乙醇提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1病毒馬克斯克魯維酵母(K.marxianus),江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。1.2試劑、培養(yǎng)基、儀器菊粉(北京威德生物科技有限公司),SephadexG-100(Pharmacia),DEAE-Cellulose(DE-52)(Whatman),分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(碧云天生物技術(shù)研究所),蔗糖、果糖等均為分析純試劑。1.3培養(yǎng)基1.3.1字母種子培養(yǎng)酵母膏10g/L,葡萄糖15g/L,菊粉5g/L,pH5.5。1.3.2固體發(fā)酵培養(yǎng)基250ml三角瓶20g麩皮,菊粉3.62%,玉米漿干粉2.4%,10mL營養(yǎng)鹽液,濕度60%,pH5.5。1.3.3mnso4hoKH2PO470g/L,MgSO4·7H2O10g/L,MnSO4·H2O0.06g/L,FeSO4·7H2O0.16g/L,ZnSO4·7H2O0.05g/L,CaCl20.07g/L。1.4固體培養(yǎng)物的提取挑取斜面活化菌種1環(huán)接入裝有50mL新鮮種子培養(yǎng)液的250mL三角瓶中,30℃,150r/min培養(yǎng)24h,按4%接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,混和均勻,28℃培養(yǎng)72h后,將固體培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一定體積的蒸餾水中,搖床常溫振蕩30min,紗布過濾,重復(fù)提取2次,合并濾液,5000r/min離心10min,取上清液。1.5還原糖含量的測定0.5mL酶液(若必要,適當(dāng)稀釋)加入到4.5mL2%的蔗糖溶液(pH4.8的0.2mol/L醋酸緩沖液配制),55℃反應(yīng)10min,沸水滅活。DNS法測還原糖含量。外切菊粉酶活力定義為:以蔗糖為底物,每分鐘水解1μmol蔗糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。1.6菊粉酶蛋白的分離和精制步驟1.7菊粉酶蛋白的分子量采用垂直板SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行酶蛋白分子量測定,分離膠濃度10%,濃縮膠濃度4.5%?？捡R斯亮藍(lán)R250染色。1.8蛋白質(zhì)濃度的測定色譜分離純化過程中蛋白濃度測定采用紫外吸收法;其他階段蛋白質(zhì)濃度測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法。1.9填料及超聲波脫氣高壓液相色譜法:色譜條件:色譜柱,Shim-packCLC-NH2150mm×4.6mm,填料粒度5μm;流動(dòng)相,乙腈與水的體積比為7∶3,用前用微孔膜過濾并用超聲波脫氣處理。RID檢測器,流速1.0mL/min,柱溫為30℃,進(jìn)樣量5μL。1.10酶解率酶解率=酶解液還原糖總量/菊粉,還原糖為果糖和葡萄糖。2結(jié)果與分析2.1外切酶的分離純化對K.marxianus發(fā)酵的粗酶液進(jìn)行硫酸銨沉淀時(shí),酶蛋白易變性失活,因此采用超濾和冷凍干燥濃縮發(fā)酵液,用離子交換樹脂和葡聚糖凝膠對菊粉外切酶進(jìn)行分離純化。2.1.1外切酶活力測定根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的菊粉酶分子量,采用60000中空纖維素膜對K.marxianus發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮,對濾液的菊粉外切酶酶活力進(jìn)行測定時(shí),沒有測出酶活,表明K.marxianus菊粉外切酶留在了超濾濃縮液中。把超濾濃縮液裝入透析袋,透析脫除無機(jī)鹽,然后用聚乙二醇20000進(jìn)一步濃縮,然后進(jìn)行冷凍干燥。2.1.2deea-cli-mool-tholmoe的分離和純化據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,菊粉酶的等電點(diǎn)一般在4.5左右,因此用DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂對濃縮酶液進(jìn)行菊粉外切酶酶蛋白分離,在280nm由處用紫外檢測儀和色譜信號采集單元進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,得到洗脫曲線和酶蛋白峰(箭頭所指)如圖1所示。分離條件:柱:2.6cm×30cm,裝柱25cm;起始緩沖液:pH7.00.02mol/L磷酸緩沖液;流量2mL/min;用0.1-0.5mol/LNaCl的磷酸緩沖液階段梯度洗脫。每管收集5mL,上樣量2mL。由洗脫曲線可以看出,①用起始緩沖液洗脫的蛋白峰沒有檢測到酶活,說明洗脫出的是雜蛋白,菊粉酶蛋白全部被吸附到離子交換樹脂上。由此證明菊粉酶的PI<7.0,所選擇的離子交換劑和緩沖液pH適于分離菊粉酶。②用含0.1mol/LNaCl磷酸緩沖液洗脫時(shí)得到1個(gè)酶蛋白峰,經(jīng)酶活測定具有菊粉酶活性,收集該蛋白峰。③用0.2-0.5mol/LNaCl磷酸緩沖液洗脫的蛋白峰,均沒有檢測到酶活。由此通過第1次DEAE-Cellulose陰離子交換層析,初步分離得到了所需的菊粉外切酶。將酶蛋白峰收集,進(jìn)行透析脫鹽濃縮,再進(jìn)行DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂分離。梯度洗脫后,得到洗脫曲線和菊粉酶酶蛋白峰(箭頭所指)如圖2所示。由圖2洗脫曲線可以看出,①用起始緩沖液洗脫時(shí),沒有蛋白峰出現(xiàn),說明菊粉外切酶全部被吸附到離子交換樹脂上。②因用DE-Cellulose陰離子交換樹脂第一次分離純化菊粉外切酶時(shí),0.1mol/LNaCl磷酸緩沖液把酶蛋白全部洗脫下來,再用DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂進(jìn)一步分離時(shí),采用含0.05mol/L和0.1mol/LNaCl磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫,從圖2可知其分別洗脫出酶蛋白峰,經(jīng)酶活測定都具有菊粉酶活性,分別收集蛋白峰。③用0.5mol/LNaCl磷酸緩沖液洗脫出蛋白峰,沒有檢測到酶活。它的出現(xiàn)可能是DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂第一次分離時(shí),0.1mo1/LNaCl洗脫時(shí)一些沒有被吸附的蛋白一起洗脫下來,與酶蛋白混合在一起被收集起來。選擇0.5mol/LNaCl磷酸緩沖液洗脫去除雜蛋白是因?yàn)榈蜐舛鹊腘aCl磷酸緩沖液無法完全去除雜蛋白,造成下次柱層析時(shí)酶蛋白不能交換到DEAE-Cellulose上,用磷酸緩沖液洗脫時(shí),出現(xiàn)穿過峰,且洗脫的蛋白具有菊粉酶酶活,而進(jìn)行NaCl溶液梯度洗脫時(shí)沒有蛋白峰出現(xiàn)或僅有少量酶蛋白洗脫出,這表明用磷酸緩沖液洗脫時(shí),菊粉外切酶大部分被先洗脫下來。通過第2次DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂進(jìn)一步對菊粉外切酶進(jìn)行了分離純化。2.1.3蛋白峰的測定將得到的2個(gè)酶蛋白組分分別進(jìn)行透析脫鹽濃縮后,分別加入預(yù)先用pH7.0,0.02mol/L磷酸緩沖液平衡的SephadexG-100凝膠柱(l.0×80cm),凝膠高75cm,上樣量3mL,用pH7.0,0.02mol/L磷酸緩沖液洗脫,流速0.2mL/min,每管收集4mL。用全自動(dòng)部分收集器收集。在280mn,用紫外分光光度計(jì)測每管的吸光值,測定蛋白峰各管酶活。進(jìn)行SephadexG-100凝膠層析時(shí),第2次DEAE-Cellulose陰離子交換層析中用0.05mo1/LNaCl和0.1mo1/LNaCl磷酸緩沖液洗脫的2酶活力峰又各被分為2個(gè)蛋白峰。分別測定這些蛋白峰的酶活,2個(gè)蛋白峰中均只有第1峰有酶活,將其收集待用。為方便,分別命名為菊粉外切酶Ⅰ(ExoⅠ)和Ⅱ(ExoⅡ)。K.marxianus菊粉外切酶經(jīng)超濾、DEAE-Cellulose陰離子交換層析和SephadexG-100凝膠層析等蛋白分離方法分離純化,其比活力、酶活回收和純化倍數(shù)見表1,從表1可知,粗酶液經(jīng)各步分離純化后,菊粉外切酶的比活力有很大提高,達(dá)到353.66U/mg,純化倍數(shù)為51.48。2.2外切型菊粉酶活性按照作用方式的不同,菊粉酶分為內(nèi)切型菊粉酶和外切型菊粉酶。內(nèi)切型菊粉酶隨機(jī)地?cái)嚅_菊粉內(nèi)部的糖苷鍵,水解菊粉為功能性低聚果糖;外切型菊粉酶作用于菊粉鏈的非還原性末端的糖苷鍵,逐個(gè)水解切下果糖基,形成D-果糖。外切型菊粉酶在高果糖漿和燃料乙醇的生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。本文通過分離純化得到2種馬克斯克魯維酵母菊粉外切酶酶Ⅰ和Ⅱ,用高壓液相色譜法(HPLC)對其水解菊粉的產(chǎn)物進(jìn)行分析。酶解條件:10%菊粉溶液(0.2mol/LpH4.6醋酸緩沖液配制),加酶量60U/g,55℃,pH4.6,保溫8h。從圖3-圖4可以看出,菊粉外切酶Ⅰ水解菊粉的產(chǎn)物主要是果糖,而菊粉外切酶Ⅱ酶解液果糖和葡萄糖含量很少,由此可知ExoⅠ菊粉酶酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ExoⅡ。這說明就以菊芋為原料制備果糖發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇而言,ExoⅠ才是真正需要的組分。2.3外切酶系統(tǒng)基因的檢測ExoⅠ是主要的菊粉外切酶,含量也高于ExoⅡ(見圖2),對水解菊粉生成果糖和發(fā)酵果糖生產(chǎn)乙醇起關(guān)鍵作用,因此對ExoⅠ進(jìn)行主要研究。采用SDS測定菊粉外切酶Ⅰ的分子質(zhì)量,計(jì)算測得結(jié)果為85ku(圖5)。由于菊粉酶產(chǎn)生菌種不同,以及提純方法的差別,有關(guān)酶分子質(zhì)量測定的報(bào)道差別較大,如A.ficuum(74ku),A.versicolor(230ku),A.candida(54ku),A.awamori(69ku),而Uhm等從Aspergillusniger分離到的3種菊粉酶分子質(zhì)量高達(dá)300ku。2.4不同濃度菊粉外切酶的酶解率由上文可知,分離純化的K.marxianus菊粉外切酶能分解菊粉生成果糖和葡萄糖,但ExoⅠ酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ExoⅡ。因此,采用分離純化的ExoⅠ水解菊粉,研究了加酶量、溫度、pH、菊粉濃度、酶解時(shí)間對酶解率的影響。時(shí)間是影響酶解率的一個(gè)因素,反應(yīng)時(shí)間越長酶解率越高,但反應(yīng)時(shí)間過長不利于生產(chǎn)。以10%菊粉溶液,加酶60U/g,pH4.0,55℃,保溫酶解2、4、8、20h,酶解率分別為55.26%、63.19%、70.70%、75.97%。酶解率在8h已達(dá)70.70%,8h后,隨著時(shí)間的延長,并不能顯著提高其酶解率,原因可能是高濃度的果糖對菊粉外切酶Ⅰ具有抑制作用。因此從經(jīng)濟(jì)和能耗的角度考慮,酶解時(shí)間選擇8h。由圖6A可知,10%的菊粉溶液,在pH4.0,55℃保溫酶解8h,加酶量為20U/g、40U/g、60U/g、80U/g、100U/g時(shí),酶解率分別為63.32%、65.12%、66.52%、71.91%和72.18%。菊粉外切酶Ⅰ對菊粉的酶解率隨酶量的增加而增加,當(dāng)加酶量達(dá)到80U/g時(shí),上升趨勢減緩,表明酶量繼續(xù)增加不能顯著提高菊粉外切酶對菊粉的酶解率,因此加酶量選擇80U/g。對5%、10%、15%、20%、25%五種不同菊粉溶液,在加酶量80U/g,pH4.0,55℃,酶解8h條件下酶解菊粉。其酶解率分別達(dá)到68.80%、70.71%、67.15%、60.15%和63.85%,差別不大,這表明菊粉濃度對酶解效率影響并不十分明顯。10%菊粉濃度的酶解率最高,但菊粉濃度過高,可能對酶有一定抑制作用,導(dǎo)致降解率下降。選擇pH為3.6、4.0、4.6、5.0、5.6,進(jìn)行酶解菊粉的研究。其他酶解條件為:菊粉溶液10%,加酶80U/g,55℃保溫酶解8h,結(jié)果如圖6C,降解率分別為66.20%、67.84%、73.40%、70.06%、69.68%?？芍钸mpH為4.6。在上述4種最優(yōu)條件下,選擇45、50、55、60、65℃研究溫度對酶解菊粉的影響,結(jié)果如圖6D。由圖6D可知,其降解率分別為71.59%、73.52%、69.75%、55.92%、58.758%,50℃時(shí)降解率最高,但隨溫度繼續(xù)升高,其降解率則下降,這可能由于溫度過高導(dǎo)致酶蛋白變性和菊粉外切酶本身的熱穩(wěn)定性差的緣故,65℃酶解率稍高于60℃可能由于菊粉隨溫度增高其自身的降解率也增加的緣故。3菊粉外切酶的變化采用超濾、DEAE-Cellulose陰離子交換色譜、SephadexG-100凝膠色譜等蛋白分離方法,從馬克斯克魯維酵母固體發(fā)酵醪中制備菊粉外切酶,獲得菊粉外切酶酶蛋白Ⅰ和Ⅱ。粗酶液經(jīng)各步分離純化后,菊粉外切