6種常用中藥中核苷類成分的測定

6種常用中藥中核苷類成分的測定

格林威治是生物細(xì)胞維持生命的重要藥物，具有免疫調(diào)節(jié)、改善細(xì)胞代謝、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)等生理活性。目前核苷已作為藥品、保健品和食品添加劑在市場上銷售,也是一些補益中藥如冬蟲夏草和靈芝的質(zhì)量控制指標(biāo)。作者認(rèn)為,核苷可能是補益中藥的共有物質(zhì)基礎(chǔ),但核苷類成分在其他補益中藥中的分析少見報道。本文應(yīng)用高效液相色譜法測定了除冬蟲夏草、靈芝和三七外的6種常用補益中藥人參、黃芪、熟地黃、當(dāng)歸、麥冬和肉蓯蓉中尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷的含量,以明確被測成分在此6種中藥中的含量,為探究核苷類化合物在補益中藥中的作用奠定基礎(chǔ)。1藥材、藥品和試劑Agilent1100高效液相色譜儀,包括四元泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器及化學(xué)工作站(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA,USA);MilliporeMilli-QPlus超純水制備系統(tǒng)(Millipore,Bedford,MA,USA);平行反應(yīng)器(BUCHI-Syncore,Flawil,Switzerland)。黃芪、熟地黃、麥冬、肉蓯蓉購自廣東珠海市藥店,人參采自吉林撫松縣,當(dāng)歸采自甘肅岷縣,藥材經(jīng)澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院李紹平教授鑒定,分別為膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.]、地黃(RehmanniaglutinosaLibosch)、麥冬[Ophiopogonjaponicus(Thunb.)Ker-Gawl]、管花肉蓯蓉[Cistanchetubulosa(Schenk)Wight]、人參(PanaxginsengC.A.Mey)和當(dāng)歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的相應(yīng)藥用部位。對照品尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷購自Sigma公司(St.Louis,MO,USA),純度均大于98%。乙腈為色譜純,購自Merck公司;甲酸為分析純,購自廣東省光華化學(xué)有限公司。水為Milli-Q水。2線性關(guān)系和定量限、回收率試驗2.1對照品儲備液的制備準(zhǔn)確稱取對照品尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷適量,分別置于5mL量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,搖勻,制得尿苷(77.32μg·mL-1)、腺嘌呤(58.29μg·mL-1)、鳥苷(90.73μg·mL-1)、腺苷(157.07μg·mL-1)的對照品儲備液。2.2供試品溶液的制備取干燥藥材粉末(60目篩)0.5g,精密稱定,精密加水15mL后稱重,平行反應(yīng)器100℃提取90min,用水補足失重,提取液13000r·min-1離心5min,上清液用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.3色譜條件ZorbaxSB-Aq分析柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相為0.05%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～12min,0%B;12～17min,0%B→2%B;17～27min,2%B;27～45min,2%B→20%B),流速0.5mL·min-1;檢測波長260nm;柱溫30℃;進樣量15μL。在此條件下,尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷均達到基線分離,樣品中成分對分析無明顯干擾(麥冬除外,其成分對腺嘌呤分析有明顯影響),見圖1。1.尿苷(uridine)2.腺嘌呤(adenine)3.鳥苷(guanosine)4.腺苷(adenosine)2.4線性關(guān)系考察分別準(zhǔn)確量取尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的對照品儲備液適量,加水稀釋成6個濃度的系列對照品混合溶液,以0.45μm微孔濾膜過濾后供HPLC分析。以各對照品峰面積Y對濃度X(μg·mL-1)進行線性回歸。尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的回歸方程及最低檢測限(LOD,S/N=3)和最低定量限(LOQ,S/N=10)見表1。2.5精密度考察取同一份對照品混合溶液,同一天連續(xù)進樣6次,計算各峰面積,考察日內(nèi)精密度;每天進樣2次,連續(xù)測定3d,計算各峰面積,考察日間精密度。結(jié)果尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的日內(nèi)精密度RSD(n=6)分別為0.1%,0.1%,0.0%,0.1%;日間精密度RSD(n=6)分別為0.5%,0.2%,0.7%,1.0%。2.6重復(fù)性考察精密稱取同一當(dāng)歸樣品粉末0.25g、0.50g、0.75g各3份,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,分別測定,計算峰面積,結(jié)果低、中、高濃度下,尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷含量平均值(n=3)分別為151,87,187,270μg·g-1;RSD分別小于1.4%,2.7%,4.5%,2.1%。2.7加樣回收率考察精密稱取已知含量的當(dāng)歸(甘肅岷縣)粉末3份,每份約0.25g,按各成分在原藥材中的含有量分別精密加入等量的對照品,按“2.2”項下方法制備供試液,測定并計算加樣回收率,結(jié)果尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷平均加樣回收率(n=3)和RSD分別為98.3%,0.6%;103.4%,1.7%;97.9%,0.8%;97.2%,1.8%。2.8樣品測定精密稱取各樣品粉末0.5g,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,每個樣品平行制備2份,采用外標(biāo)法測定尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量,結(jié)果見表2。3討論3.1提取時間的確定中藥傳統(tǒng)使用方法為水煎煮,因此本實驗選擇水加熱提取作為提取方法。首先對提取時間進行了考察,分別對提取30,60,90,120min后當(dāng)歸樣品中4個待測成分的峰面積進行了比較,結(jié)果顯示待測組分的峰面積在90min后不再明顯增加,故選擇提取時間為90min。溶劑使用量分別考察了相當(dāng)于藥材重量10倍、20倍、30倍、40倍體積的溶劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)30倍體積的溶劑量對4個待測成分的提取效率最高,故選擇30倍體積的溶劑量進行樣品提取。3.2zorbaxbs-aq分析柱的選擇由于核苷類和堿基類化合物的極性較大,因此選擇可以用純水做流動相的ZorbaxSB-Aq分析柱用于本實驗的色譜分離。同時比較了不同的流動相組成如乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、甲醇-水和甲醇-甲酸水溶液,結(jié)果顯示乙腈-甲酸水溶液做流動相時分析物的峰形最好。3.3中醫(yī)所需中藥量對質(zhì)量的影響本研究選擇補氣藥人參、黃芪,補血藥熟地黃、當(dāng)歸,補陰藥麥冬,補陽藥肉蓯蓉為對象,分析結(jié)果表明,6個補益中藥均含有核苷類化合物,其中補氣藥人參、黃芪和補血藥當(dāng)歸同時含有被測的4個成分并且含量較高。以冬蟲夏草為參照,將本文測定結(jié)果結(jié)合中國藥典(2005年版)中各味藥用量計算可知,本文選擇的6味補益中藥在藥典用量下尿苷總量均低于冬蟲夏草,但黃芪中腺嘌呤、鳥苷和當(dāng)歸中腺苷量則高于冬蟲夏草;人參中鳥苷和腺苷用量在同等用藥量時高于冬蟲夏草。中醫(yī)補益法就是通過補益藥的運