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文檔簡介

第四章

蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)Protein蛋白質(zhì)-英文為“Protein”

——第一重要

本章重點內(nèi)容肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物學功能一、蛋白質(zhì)的化學組成和分類1、蛋白質(zhì)是一類含氮有機化合物,除含有C、H、O外,還有N和少量的S、P

。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素,主要是P、Fe、Cu、Co、Mn、Zn等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為:碳50%氫7%氧23%氮16%

硫0—3%其他微量2、蛋白質(zhì)的含氮量☆蛋白氮占生物組織中所有含氮物質(zhì)的絕大部分。因此,可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質(zhì)的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%,所以,可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質(zhì)的大概含量:☆蛋白質(zhì)含量(克%)=每克生物樣品中含氮的克數(shù)

6.253、蛋白質(zhì)的大小與分子量

蛋白質(zhì)是分子量(Mr)很大的生物分子。對任一種給定的蛋白質(zhì)來說,它的所有分子在氨基酸的組成和順序以及肽鏈的長度方面都應(yīng)該是相同的,即所謂均一的蛋白質(zhì)。4、蛋白質(zhì)的分類什么叫單純蛋白質(zhì)、綴合蛋白質(zhì)?輔基(或配體)?分類方法;球狀蛋白質(zhì)、纖維狀蛋白質(zhì)、膜蛋白(質(zhì));單體蛋白質(zhì)、寡聚蛋白質(zhì)、亞基(亞單位);二、蛋白質(zhì)的構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)

結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)(初級)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)高級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象

在二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間還有另一些層次,如超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)的功能與分布單細胞生物胞外酶鞭毛-蛋白質(zhì)(運動器官)細胞壁-糖、脂、肽細胞膜-載運蛋白、酶蛋白細胞質(zhì)-酶蛋白(催化物質(zhì)代謝)細胞核-酶蛋白(催化遺傳)多細胞生物個體層次毛發(fā)、皮膚——角蛋白骨骼、牙齒——鈣+膠原蛋白蛋白質(zhì)分布廣泛、功能多樣1.催化功能-酶2.結(jié)構(gòu)功能-皮、毛、骨、牙、細胞骨架3.載運功能-膜蛋白4.調(diào)控功能-激素5.運動功能-鞭毛、肌肉蛋白6.防御功能-免疫球蛋白7.神經(jīng)傳導基本功能輔助功能氨基酸的連接方式——肽鍵(peptidebond)三、肽蛋白質(zhì)——多聚氨基酸肽鍵(酰胺鍵)(一)肽和肽鍵

一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵,所形成的化合物稱為肽。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽,由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。多肽鏈(polypeptidechain)

1、氨基末段(-NH2)和羧基末端(-COOH)

2、命名:“某氨基酰某氨基酰?

?

?

?

?

?某氨基酸”

3、肽鏈和肽鍵;主鏈和側(cè)鏈;氨基酸殘基

4、二硫鍵、鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵在多肽鏈中,氨基酸殘基按一定的順序排列,這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈的一端含有一個游離的

-氨基,稱為氨基端或N-端;在另一端含有一個游離的

-羧基,稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始,以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。如上述五肽可表示為:

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

很多多肽都采用俗名,如催產(chǎn)素、胰島素等。(二)天然存在的重要多肽在生物體中,多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是,也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類通常具有特殊的生理功能的多肽,常稱為活性肽。如:腦啡肽;激素類多肽;抗生素類多肽;谷胱甘肽;蛇毒多肽等。短鏈且具有生物功能的多肽不算蛋白質(zhì),通常稱為活性肽!垂體后葉分泌的催產(chǎn)素(9肽,促使妊娠子宮收縮)、加壓素(9肽,升高血壓)等。一些抗生素(antibiotics)也是肽或肽衍生物,如短桿菌肽S。放線菌素(actinomycinD,國產(chǎn)品稱更生霉素Dactinomycin,DTM)是從鏈霉菌屬中分離出的,它可以與模板DNA結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄,從而抑菌,臨床上用于惡性葡萄胎、絨毛膜上皮癌等,但毒性大,使用少。一些蕈(mushrooms)產(chǎn)生的巨毒毒素也是肽類化合物,如α-鵝膏蕈堿是從鵝膏蕈屬(或捕蠅蕈屬)(Amanitaphalloides)分離的環(huán)狀八肽,它能與真核細胞的RNA聚合酶(RNApolymerase)Ⅱ牢固結(jié)合,使RNA的合成不能進行,但不影響原核生物的RNA合成。腦啡肽是具有嗎啡作用的5肽長度的活性肽,其功能不太清楚,但目前在神經(jīng)生物學和神經(jīng)精神病學中的研究前景廣闊。

肌肉中的鵝肌肽(β-丙氨酰-1-甲基組氨酸)和肌肽(β-丙氨酰組氨酸),在骨骼肌中的含量很高,達20~30mmol,但其功能至今尚不清楚,估計與肌肉收縮有關(guān)。谷胱甘肽(glutathione,GSH):是一種稱為

-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸的三肽化合物。Glu-Cys-Gly|

S|S|Glu-Cys-Gly谷胱甘肽分子中的巰基可氧化或還原,故有還原型(GSH)與氧化型(GSSG)兩種存在形式。2×Glu-Cys-Gly|

SH-2H+2H★解毒作用:與毒物或藥物結(jié)合,消除其毒性作用;★參與氧化還原反應(yīng):作為重要的還原劑,參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng);★保護巰基酶的活性:使巰基酶的活性基團-SH維持還原狀態(tài);★維持紅細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定:消除氧化劑對紅細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞作用。谷胱甘肽的生理功用:

蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線,通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到1000000道爾頓甚至更大。四、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(primarystructure):是指構(gòu)成蛋白質(zhì)的各種氨基酸的種類、數(shù)量、連接方式和排列順序,由遺傳信息(遺傳密碼)所決定。涉及的化學鍵是肽鍵和少量的二硫鍵。研究意義

1、從分子水平上研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,為蛋白質(zhì)的人工合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2、診斷遺傳病、合成基因探針等高新技術(shù)的研究具有重要意義。

我國1965年在世界上第一個用化學方法人工合成的蛋白質(zhì)就是這種牛胰島素。胰島素(Insulin):

由胰島β-細胞分泌的含N類激素。結(jié)構(gòu)上由51個AA殘基所組成,可分為A、B兩條鏈。A鏈含有21個AA殘基,B鏈含30個AA殘基。A、B兩鏈之間通過兩個二硫鍵聯(lián)結(jié)在一起,A鏈還含有一個鏈內(nèi)二硫鍵。

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來,現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定①.多肽鏈數(shù)目的測定根據(jù)蛋白質(zhì)N端和C端殘基的摩爾數(shù)和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量可確定分子中的多肽鏈數(shù)目。若含一條多肽鏈,蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)與末端基的摩爾數(shù)相等;如果后者是前者的倍數(shù),說明該蛋白質(zhì)分子是由多條多肽鏈組成。如果檢測到的末端基多于一種,表明蛋白質(zhì)由兩條或多條不同的多肽鏈組成,即樣品是雜多聚蛋白質(zhì)(heteromultimericprotein)。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起,稱為寡聚蛋白質(zhì),如血紅蛋白為四聚體②.拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈寡聚蛋白質(zhì)的亞基必須拆分??捎米冃詣┤?mol/L尿素、6mol/L鹽酸胍或高濃度鹽處理。③.拆開多肽鏈內(nèi)的二硫橋若亞基間通過二硫橋(S-S)交聯(lián),如胰島素(含兩條多肽鏈)和α-胰凝乳蛋白酶(含3條多肽鏈)則可在可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下,用過量的

-巰基乙醇處理,使二硫鍵還原為巰基,然后用烷基化試劑保護生成的巰基,以防止它重新被氧化。④.測定每一條多肽鏈的氨基酸組成分離純化的多肽鏈一部分樣品完全水解,測定氨基酸組成,計算氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。現(xiàn)在已有氨基酸自動分析儀和蛋白質(zhì)序列儀,對蛋白質(zhì)多肽氨基酸排列順序的測定提供了極大的方便。⑤.鑒定多肽鏈的N端和C端殘基多肽鏈的另一部分樣品進行末端殘基的鑒定,以便建立兩個重要的氨基酸序列參考點。⑥.裂解多肽鏈成較小的片段用兩種或幾種不同的斷裂方法(指斷裂點不一樣)將每條多肽鏈樣品降解成兩套或幾套重疊的肽段或稱肽碎片。每套肽段進行分離、純化,并對每一純化了的肽段進行氨基酸組成和末端殘基的分析。⑦.測定各肽斷的氨基酸序列最常用Edman降解法,并有自動序列分析儀可供利用,此外尚有酶解法和質(zhì)譜法等。以氨基酸自動測序儀分析,一個分子量在3萬的蛋白質(zhì),僅需6ug樣品,1小時即可測定完畢。⑧.建立完整多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)利用兩套或多套肽段的氨基酸序列彼此間有交錯重疊可以拼湊出原來的完整多肽鏈的氨基酸序列。⑨.確定半胱氨酸殘基間形成的S-S交聯(lián)橋的位置氨基酸序列測定中不包括輔基成分分析,但是它應(yīng)屬于蛋白質(zhì)化學結(jié)構(gòu)內(nèi)容。N端測定二硝基氟苯(DNFB或FDNB,sanger試劑)法DNFB與AA的α-NH2的反應(yīng)被廣泛用于測定N-末端AA。多肽或蛋白質(zhì)的游離末端NH2與DNFB反應(yīng)生成DNP-多肽或DNP-蛋白質(zhì)對酸水解比肽鍵穩(wěn)定,因此DNP-多肽經(jīng)酸水解后,只有N-末端AA為黃色DNP-AA衍生物,其余的都是游離AA。用有機溶劑(如乙酸乙酯)將DNP-AA抽提出來,再運用紙層析、薄層層析或HPLC進行定性和定量分析,便可得知多肽鏈的N-末端殘基。此法的缺點是所有的肽鍵都被水解掉了。丹磺酰氯(dansylchloride,DNS)法丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡稱,原理與DNFB法相同。丹磺酰基有強烈的熒光,靈敏度比DNFB法高100倍,且水解后的DNS-AA不需提取,可直接用紙電泳或薄層層析加以鑒定。苯異硫氰酸酯(PITC,Edman試劑)法多肽和蛋白質(zhì)的末端氨基和AA的α-NH2能與PITC作用,生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白質(zhì),稱PTC-多肽或蛋白質(zhì),它在酸性有機溶劑中加熱時,N末端的PTC-AA環(huán)化,生成苯乙內(nèi)酰硫脲的衍生物并從肽鏈上脫下,除去N端AA的肽鏈仍然完整。代表N端殘基的PTH-AA經(jīng)有機溶劑抽提干燥后,可用薄層層析(如硅膠薄膜或聚酰胺薄膜)、氣相色譜和HPLC鑒定。除N端的氨基酸外,其余多肽鏈會保留下來,可以繼續(xù)不斷的測定其N端。C端測定肼解(hydrazinolysis)法

C端測定的重要方法。所有的肽鍵(酰胺)都與肼反應(yīng)而斷裂成酰肼,只有C端的氨基酸有游離的羧基,不會與肼反應(yīng)成酰肼。即,與肼反應(yīng)后仍具有游離羧基的氨基酸就是多肽C端的氨基酸羧肽酶(carboxypeptidase)法有效和常用。專一性從C端逐個水解出游離AA,被釋放的AA數(shù)目與種類隨反應(yīng)時間而變化,由此推測C端氨基酸序列。幾個氨基酸釋放速度相近或兩個相同氨基酸毗鄰時,小心結(jié)果。外肽酶:分別從肽鏈羧基端和氨基端水解羧肽酶和氨肽酶Trypsin:只水解羰基屬于賴氨酸、精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。水解位點胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin):R1苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵亮氨酸Leu,蛋氨酸Met和組氨酸His水解稍慢水解位點糜蛋白酶Pepsin:R2苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr等疏水氨基酸殘基的氨基端肽鍵亮氨酸Leu以及

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