農(nóng)學(xué)畢業(yè)論文

水稻和大麥耐鹽性的比較基因組學(xué)研究郭秋林（農(nóng)學(xué)，310118）摘要：大麥（HordeumvulgareL.）是最耐鹽的禾本科作物之一，其野生種質(zhì)中蘊(yùn)含豐富的耐性基因資源，這些基因通過(guò)多種分子機(jī)制調(diào)控植株的耐鹽性。然而，水稻是禾本科作物中耐鹽差的物種之一。但大麥和水稻在基因組序列及其體現(xiàn)模式上具有高度相似性。這些基因往往較保守，在生長(zhǎng)中具有功能明顯性和等效性，稱為共有基因，具有某些轉(zhuǎn)錄因子、酶家族、構(gòu)造蛋白等，這些基因的作用也許與耐鹽性有關(guān)。本試驗(yàn)選用以水稻日本晴(Oryzasativasubsp.Japonica)和西藏野生大麥XZ26（Hordeumvulgatesubsp.spontaneum）為代表材料，用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ふ饮}脅迫下大麥與水稻基因組中響應(yīng)鹽脅迫的共有基因和物種間特異體現(xiàn)基因，結(jié)合對(duì)應(yīng)的耐鹽表型與元素含量進(jìn)行分析，初步探索大麥和水稻基因組與耐鹽性的關(guān)系，從基因?qū)用娼沂敬篼満退疚锓N間耐鹽的有關(guān)機(jī)理，為水稻耐鹽性改良提供理論參照。關(guān)鍵詞：鹽脅迫；差異體現(xiàn)基因；體現(xiàn)型；元素含量;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。ComparativegenomicsanalysisofsalttolerancebetweenriceandbarleyQiu-linGuo(Agronomy,310118)Abstract:Amonggramineouscrops,barley(HordeumvulgareL.)isoneofthemostsalt-tolerantspecies,whichcontainsrichresourcesofsalt-tolerancegenesregulatingsalttoleranceofplantsinitswildgermplasm.However,riceissaltsensitive.Barleyandricehavehighsimilarityinthegenomesequencesandtheexpressionpatternofgenes.Theseconservativegenesinbarleyandrice(cBRgenes)includingtranscriptionfactors,enzymefamilies,structuralproteinsmaintainthelawofgrowthregulation,whichplayingimportantrolesinsalttolerance.Inthisstudy,ricecultivarNipponbare(Oryzasativasubsp.Japonica)andaTibetanwildbarleyXZ26(Hordeumvulgatesubsp.Spontaneum)wereselectedforthisresearch.ThecBRsdifferentlyregulatedinriceandbarleyundersaltstresswereidentifiedthroughRNA-seq.ThenthecorrelationbetweencBRsgenesandsalttoleranceinbarleyandricewasdiscussed,revealingthemechanismofsalttolerancebetweenthetwocropsatthegenomelevel,whichcouldprovideavaluablereferenceforimprovingandbreedinginrice.Keywords:Saltstress;differentiallyexpressedgenes;phenotype;elementcontent;RNA-seq.

目錄1.引言 32.研究背景綜述 32.1大麥的耐鹽機(jī)理 32.2大麥與水稻的耐鹽性比較 42.3轉(zhuǎn)錄組及其測(cè)序技術(shù)（RNA-seq） 43.材料與措施 43.1試驗(yàn)材料 53.2植株處理與取樣 53.3元素含量測(cè)定 63.4RNA提取與RNA-Seq分析 63.5數(shù)據(jù)分析 84.文獻(xiàn)綜述 94.1大麥和水稻耐鹽性比較 94.2鹽脅迫對(duì)大麥及水稻元素含量的影響 104.3鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組分析 145.討論 225.1響應(yīng)基因的體現(xiàn)與耐鹽性的關(guān)系 225.2大麥和水稻耐鹽性差異的基因組層面的探討 235.3研究展望及局限性之處的改善 23參照文獻(xiàn) 24

1.引言土地鹽漬化是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一，鹽害的產(chǎn)生來(lái)源多種多樣，最普遍的是植物蒸騰作用引起的地下礦質(zhì)資源上升到土表，這一趨勢(shì)伴隨全球變暖和精耕細(xì)作深入加劇。目前，全球大概有8.31億hm2的土地已受到鹽漬化的威脅，而我國(guó)鹽漬土面積約為3600萬(wàn)hm2[3]。鹽害對(duì)植物的毒害作用重要有滲透克制、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)失調(diào)和離子毒害等[2]。水稻是我國(guó)種植面積最大、單產(chǎn)最高糧食作物，總產(chǎn)目前位居我國(guó)第二。作為重要糧食，稻米在全國(guó)居民糧食消費(fèi)中占65％以上。水稻的年種植面積約占全國(guó)糧食作物的30％，總產(chǎn)量則要占40％以上，建國(guó)以來(lái)，我國(guó)稻米生產(chǎn)有了較大的發(fā)展，總產(chǎn)量不停增長(zhǎng)，為我國(guó)糧食生產(chǎn)做出了重大的奉獻(xiàn)[3,29]。耐鹽性作為水稻品種改良方向之一，備受關(guān)注[6]。水稻對(duì)于土壤鹽分具有極大的敏感性，這嚴(yán)重威脅到了我國(guó)糧食供應(yīng)，影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)超過(guò)120億[4-5]。大麥?zhǔn)呛瘫究颇望}作物的代表之一，且資源分布與適應(yīng)性廣[6]。因此，研究大麥的耐鹽性與水稻的鹽敏感性可為揭示植物耐鹽機(jī)理提供重要的參照和指導(dǎo)；對(duì)大麥耐鹽有關(guān)基因組的研究及其與水稻的同源基因比較，將對(duì)克隆耐鹽基因與培育耐鹽水稻新品種提供重要的理論根據(jù)和技術(shù)支持。2.研究背景綜述2.1大麥的耐鹽機(jī)理 大麥適應(yīng)性廣，耐鹽性強(qiáng)，其野生抗逆種質(zhì)資源豐富大麥作為一種耐鹽作物[1]。近年來(lái)，某些研究者對(duì)青藏高原一年生野生大麥開展了遺傳多態(tài)性分析和干旱、酸鋁及鹽害等非生物脅迫耐性鑒定和優(yōu)秀種質(zhì)的發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)青藏高原一年生野生大麥具有豐富的遺傳多態(tài)性和耐非生物脅迫的遺傳變異[2,4]。浙江大學(xué)大麥課題組從西藏野生大麥材料中鑒定到耐鹽性具有明顯差異的種質(zhì)資源，如XZ16、XZ26、XZ169等，其中XZ26具有優(yōu)秀的耐鹽性[3,23]。 普遍認(rèn)為，滲透脅迫、離子毒害和次生脅迫是鹽脅迫對(duì)植物導(dǎo)致危害的重要機(jī)制[1,2]。如某些植物受鹽脅迫時(shí)，Cl-的毒害作用往往表目前克制植物的光合作用[6]，而細(xì)胞中過(guò)多的Na+積累將導(dǎo)致離子失衡并產(chǎn)生特異性損傷。目前，滲透調(diào)整、離子平衡和抗氧化作用被認(rèn)為是植物的重要耐鹽機(jī)制[29]。如植物在脅迫下產(chǎn)生大量的活性氧自由基（ROS），導(dǎo)致一系列次生脅迫，植物通過(guò)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)清除掉一部分的ROS，轉(zhuǎn)基因植物試驗(yàn)研究中，過(guò)量體現(xiàn)抗氧化酶有關(guān)基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)化植株對(duì)滲透和氧化脅迫的耐性[9]。大麥耐鹽機(jī)制波及到多種生理途徑與調(diào)整[2]，最重要的是離子轉(zhuǎn)運(yùn)平衡，包括滲透調(diào)整的改善、根部Na+的攝入與Na+回流根際土壤的調(diào)整、木質(zhì)部離子運(yùn)送的調(diào)控、細(xì)胞中K+、Na+的置換與保留、細(xì)胞內(nèi)Na+的區(qū)隔以及對(duì)氧化脅迫的耐受等[31]?？傮w而言可被分為如下幾方面：（1）Na+排出機(jī)制；（2）K+保留；（3）氧化脅迫耐性；（4）滲透調(diào)整[27,31]。闡明各個(gè)機(jī)制的作用原理及其在大麥耐鹽性上的相對(duì)作用，對(duì)于指導(dǎo)大麥及其他作物的耐鹽性研究無(wú)疑具有重要的意義。2.2大麥與水稻的耐鹽性比較 相比較而言，大麥與水稻大概在5000萬(wàn)到1億年發(fā)生分化，具有相稱悠久的歷史，但在其基因組的構(gòu)成乃至RNA修飾、蛋白構(gòu)造乃至功能上仍然具有較高的相似性?；蛉舨皇芄δ芗s束，其體現(xiàn)形式很輕易變化，長(zhǎng)期以來(lái)使萌發(fā)調(diào)整規(guī)律得以保持的水稻、大麥基因，體現(xiàn)序列與形式較恒定，在萌發(fā)中具有功能明顯性和等效性，有較高的研究?jī)r(jià)值[23]。此外，大麥中還存在特有的保守基因序列。鑒于大麥具有較強(qiáng)的耐鹽性，而這從主線上又是由基因進(jìn)行調(diào)控的，因而將耐鹽性的差異劃歸為基因組的比較也是十分必要的。水稻栽培種的耐鹽性普遍低于大麥，以水稻在鹽處理下的生長(zhǎng)狀況作為參照指標(biāo)，研究表明水稻幼苗期對(duì)鹽堿較敏感，同一品種在發(fā)芽期和幼苗期的耐鹽性存在一定差異，整個(gè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，水稻耐鹽性逐漸增強(qiáng)[5]。此外，有關(guān)研究[17]指出在鹽堿脅迫下，水稻成熟期的株高和稈長(zhǎng)不能很好地反應(yīng)品種間耐鹽性強(qiáng)弱，最佳取樣期在分蘗期結(jié)束前，而單株分蘗數(shù)等是衡量水稻耐鹽堿強(qiáng)弱的良好指標(biāo)[4]。有關(guān)研究表明，在檢測(cè)到的大麥、水稻構(gòu)造與功能基因中，同源數(shù)量到達(dá)57661個(gè)，大麥特有基由于4650個(gè)，即在漫長(zhǎng)進(jìn)化史中，大麥分化出少部分具有特異性的基因[2]。而水稻與大麥在同源基因的蛋白質(zhì)序列和體現(xiàn)形式上具有很高的相似性[23]。基于同源基因組和大麥特異基因組的研究?jī)r(jià)值，分析特有基因在體現(xiàn)過(guò)程中的調(diào)控機(jī)理，比較同源基因調(diào)控差異，從中找出耐鹽有關(guān)基因的也許性較高。這些基因組的分析以及文庫(kù)制備等也可以成為耐鹽水稻開發(fā)的一項(xiàng)技術(shù)儲(chǔ)備。2.3轉(zhuǎn)錄組及其測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq） 轉(zhuǎn)錄組是特定細(xì)胞或組織在特定期間或狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的集合。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組的研究可以揭示生物體的基因體現(xiàn)、研究構(gòu)造變異及發(fā)現(xiàn)新基因等。轉(zhuǎn)錄組分析的研究措施、研究平臺(tái)發(fā)生著日新月異的變化，同步生物信息學(xué)分析的內(nèi)容也在逐漸完善。分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展極大地提高了人們對(duì)轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)的分析能力，尤其是伴隨高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，RNA-Seq分析已經(jīng)逐漸成為一種常用的試驗(yàn)手段[7]。作為一種新的轉(zhuǎn)錄組研究手段，RNA-Seq運(yùn)用新一代測(cè)序技術(shù)可以更為迅速、精確地為人們提供更多的生物體轉(zhuǎn)錄信息，并在生物信息學(xué)分析等有關(guān)領(lǐng)域得以不停應(yīng)用[10]。3.材料與措施3.1試驗(yàn)材料本試驗(yàn)所用的水稻和大麥分別選用日本晴和西藏野生大麥XZ26作為試驗(yàn)材料。各取200粒左右具有活性的休眠種子。3.2植株處理與取樣3.2.1種子萌發(fā) 水稻種子發(fā)芽：取2個(gè)500mL的錐形瓶用去離子水洗凈，各加入200mL蒸餾水，供試的的日本晴種子分別放入錐形瓶中，并標(biāo)識(shí)名稱，放入培養(yǎng)箱25℃飽和濕度進(jìn)行暗室培養(yǎng)，每隔8小時(shí)換水一次，并注意輕搖混勻。48h后，用同溫去離子水沖洗一次，取2個(gè)發(fā)芽盒，標(biāo)識(shí)水洗后，墊上3層用蒸餾水浸潤(rùn)的發(fā)芽紙，將種子均勻擺在發(fā)芽紙上，加蒸餾水至浸沒(méi)。再另用濾紙加水浸濕，覆蓋在發(fā)芽盒底部，發(fā)芽盒置于25℃培養(yǎng)箱中。恒溫箱暗培養(yǎng)3d，出芽后補(bǔ)光培養(yǎng)。 大麥種子發(fā)芽：水稻種子播種7d后進(jìn)行大麥種子發(fā)芽。供試的XZ26種子用3%H2O2表面滅菌處理20min，用去離子水沖洗4次后在發(fā)芽盒中發(fā)芽，播種措施同水稻種子。發(fā)芽盒放置在25℃的生長(zhǎng)室中暗培養(yǎng)3d，出芽后補(bǔ)光培養(yǎng)。3.2.2苗期鹽脅迫處理大麥發(fā)芽9天后，將水稻和大麥幼苗各自移栽到6個(gè)盛有營(yíng)養(yǎng)液的6*8孔塑料黑箱（15L）中進(jìn)行水培，水稻、大麥各分為2個(gè)處理組與1個(gè)試驗(yàn)組。每處理（箱）各設(shè)置46=24個(gè)反復(fù)，每個(gè)反復(fù)取2粒發(fā)芽狀況良好的種子在海綿固定下種1個(gè)孔。大麥的水培箱用氣泵持續(xù)充氣。所有處理在溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照14h，黑暗10h，晝夜溫度設(shè)置為22℃/18℃，營(yíng)養(yǎng)液pH控制在5.6左右。定期更換營(yíng)養(yǎng)液，配方如表1，其中大麥?zhǔn)褂玫臓I(yíng)養(yǎng)液編號(hào)H1到H6，水稻使用的營(yíng)養(yǎng)液編號(hào)R1到R3及H1到H3[2]。元素種類營(yíng)養(yǎng)液編號(hào)化學(xué)成分濃度(g/L)每10L營(yíng)養(yǎng)液用量(mL)大量元素（大麥）H1KNO310110Ca(NO3)2·4H2O236H2MgSO4·7H2O2464H3NH4H2PO41152微量元素H4H3BO31.851MnCl2·4H2O0.99(NH4)6Mo7O24·4H2O12.36ZnSO4·7H2O1.15H5CuSO4·5H2O0.251H6Fe(Ⅲ)-EDTA42.11大量元素（水稻）R1KH2PO424.85R2MgSO4·7H2O134.85(NH4)2SO448.2R3KNO318.55Ca(NO3)2·4H2O86.4表1水稻與大麥營(yíng)養(yǎng)液配方水培8d起進(jìn)行鹽脅迫處理，每個(gè)基因型的3組處理分別將營(yíng)養(yǎng)液中NaCl的濃度設(shè)定為0mM（對(duì)照）、100mM（處理）、150mM（處理）；所有營(yíng)養(yǎng)液每3d更換一次，加緩沖液以控制pH在6.0左右，試驗(yàn)組開始時(shí)NaCl濃度每次換營(yíng)養(yǎng)液增長(zhǎng)50mM，直抵到達(dá)目的濃度，使植株逐漸去適應(yīng)高鹽環(huán)境。3.2.3取樣措施鹽處理7d（播種第33d）后對(duì)材料進(jìn)行取樣，取樣品種為XZ26、日本晴，濃度為0mM、100mM，共4組處理。每組處理各收取生長(zhǎng)狀況最佳的6個(gè)反復(fù)，每個(gè)反復(fù)分別剪取地上和地下共2部分，各自作為1個(gè)樣本。地下部的根用自來(lái)水沖洗3次，持續(xù)沖洗1min，洗去吸附在根表面的離子，地上部剪清除生長(zhǎng)狀況不佳的老葉片。取樣時(shí)就將6個(gè)反復(fù)先后分2批收取，每批隨機(jī)3個(gè)反復(fù)。第一批樣品，編號(hào)地上部S1-S12，地下部R1-R12，在80℃下烘干72h稱干物重，烘干后稱重。烘干后的樣品用于短期鹽處理的金屬元素含量測(cè)定。第二批樣品同為3個(gè)樣本，編號(hào)地上部S1-S12，地下部R1-R12，立即放于液氮冷凍烘干，-80℃保留備用于代謝含量測(cè)定（RNA-seq）[2,31]。3.3元素含量測(cè)定 取樣后，將地上部和地下部的第一批烘干后樣品，研碎后稱取重量。將樣本加入試管，冷卻后再加入10mlHNO3:H2O（1:1），用試管加熱器以160℃消煮約2h，直至消煮液只剩試管半球部分。用濾紙過(guò)濾，搜集提取液并定容至20mL，保留于試管并標(biāo)識(shí)。各樣本Na、K、Ca、Mg、Cu、Fe、Mn和Zn離子含量用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀ICP-OES（iCAP6000型號(hào)，美國(guó)賽默飛世爾科技企業(yè)）測(cè)定。3.4RNA提取與RNA-Seq分析3.4.1總RNA提取 將第二批樣品送樣，每組取液氮冷卻后的樣本約0.5g，其中地上部取第三完全展開葉，采用QIAGEN的RNeasyPlantMiniKit(50)試劑盒提取總RNA，于-80℃冷庫(kù)備用。3.4.2mRNA分離和純化通過(guò)兩次純化，使用結(jié)合有poly-T寡核苷酸的磁珠從總RNA中分離純化出具有poly-A的mRNA。環(huán)節(jié)如下：保證總RNA起始量有1ug-5ug，加NucleasefreeWater補(bǔ)齊到50ul；取15ulNEBNextOligod（T）25beads到另一種新的PCR管中；取100ul2XRNABindingBuffer洗磁珠兩次；往磁珠中加入50ul2XRNABindingBuffer和第一步中50ulRNA，吸打混勻；放入PCR儀，65℃5min；當(dāng)PCR儀的溫度到達(dá)4℃時(shí)，就拿出PCR管，室溫放置5min，使mRNA充足綁定到磁珠上；將PCR管放到磁珠板上2min，使已綁定到磁珠上的mRNA分離出來(lái)；吸走上清液，加入200ulWashBuffer洗掉未綁定的RNA；置于磁珠板上2min，吸走上清液，再洗一次；往磁珠中加入50ulElutionbuffer，吸打混勻；放入到PCR儀中，80℃2min，25℃保留；當(dāng)PCR儀溫度到達(dá)25℃，立即拿出PCR管，往PCR管中加入50ulRNABindingBuffer，吸打混勻；室溫放置5min，使mRNA充足綁定到磁珠上；按以上環(huán)節(jié)加200ulWashBuffer洗兩次；往磁珠中加入10ulNucleasefreeWater混勻，置于PCR管中80℃2min；立即將PCR管放到磁珠板上分離，等液體變澄清后，吸出6.75ul到新的PCR管中，即為mRNA。3.4.3mRNA熱打斷加入純化后的的6.75ulmRNA、2ulFirstStrandSynthesisReactionBuffer、0.5ulRandomPrimers，混勻后放到PCR儀中，94℃11min，時(shí)間一到立即拿出置于冰上。3.4.4mRNA反轉(zhuǎn)錄往上一步結(jié)束的反應(yīng)中加入0.25ulMurineRNaseInhibitor、0.5ulProtoScriptIIReverseTranscriptase，混勻后按如下程序進(jìn)行反應(yīng)合成第一條cDNA鏈：25℃10min42℃15min70℃15min4℃hold往合成的第一條連中加入24ulNucleasefreewater、4ulSecondStrandSynthesisReactionBuffer、2ulSecondStrandSynthesisEnzymeMix放到PCR儀中，16℃1h，熱蓋溫度40℃3.4.5cDNA純化（1）往上述結(jié)束的dscDNA中加入72ul(1.8x)AMPureXPbeads（2）吸打混勻，室溫放置5min（3）放置于磁珠板上，等液體變澄清（大概5min），小心吸除上清（4）往PCR管中加入200ul80%的酒精，洗30s，吸除上清，洗兩次（6）往已晾干的磁珠中加入30ul的NucleasefreeWater，吸打混勻磁珠（7）將PCR管放到磁珠板上分離（8）等液體變澄清后，吸出27.75ul到新的PCR管中3.4.6末端修復(fù)通過(guò)切除或者補(bǔ)平3’和5’突出端，得到平末端。對(duì)5’端磷酸化后，再對(duì)3'端加‘A’，使其能與下一步具有‘T’的Adapter互補(bǔ)連接加入1.5ulNEBNextEndPrepEnzymeMix、3.25ulNEBNextEndRepairReactionBuffer(10x)、27.75ul純化后dscDNA，混勻后將PCR管放入PCR儀中，按如下程序運(yùn)行：20℃30min65℃30min保留于4℃3.4.7接頭連接在雙鏈cDNA片段上加上Adapter，使其能雜交到flowcell上往末端修復(fù)結(jié)束的PCR管中加入7.5ulBlunt/TALigaseMasterMix、1.25ulDilutedNEBNextAdaptor、1.25ulNucleasefreewater，混勻后將PCR管放于PCR儀中，設(shè)置為20℃15min，時(shí)間到立即加入1.5ulUSERenzyme，混勻后放置于PCR儀中，設(shè)置為37℃15min。3.4.8磁珠篩選用0.6xAMPureXPbeads抓取600bp以上的DNA片段，再用0.8x的濃度對(duì)600bp如下的DNA片段進(jìn)行300bp以上片段的抓取，篩選出300-600bp的范圍富集PCR，環(huán)節(jié)如下：（1）往接頭連接結(jié)束的PCR管中加入1.25ulNucleasefreeWater，補(bǔ)齊到45ul（2）加入27ul(0.6x)AMPureXPbeads，吸打混勻，室溫放置5min（3）放置于磁珠板上，等液體變澄清（大概5min），吸取上清到新的PCR管中（4）再次加入9ulAMPureXPbeads，吸打混勻，室溫放置5min（5）放置于磁珠板上，等液體變澄清（大概5min），吸除上清（6）往PCR管中加入200ul80%的酒精，洗30s，吸除上清，洗兩次（7）將PCR管放置于磁珠板上，打開蓋子晾干，使其完全龜裂（大概5min）（8）往已晾干的磁珠中加入13ul的NucleasefreeWater，吸打混勻磁珠（9）將PCR管放到磁珠板上分離（10）等液體變澄清后，吸出11.5ul到新的PCR管中3.4.9PCR富集PCR選擇性的富集兩端具有接頭的DNA片段，放大cDNA文庫(kù)。向文庫(kù)中引入檢索引物以用于多樣本測(cè)序。加入11.5ul篩選后的DNA片段、12.5ulNEBNextHighFidelity2xPCRMasterMix、0.5ulIndex（X）Primer、0.5ulUniversalPCRPrimer，混勻放入PCR儀中，按如下程序進(jìn)行：預(yù)變性98°30s1個(gè)循環(huán)變性98°10s退火65°30s15個(gè)循環(huán)延伸72°30s終延伸72°5min1個(gè)循環(huán)保留4°∞3.4.10膠回收純化用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，切取350-450bp之間的片段，用QIAGEN膠回收試劑盒進(jìn)行回收，剩余2ul用Qubit測(cè)RNA濃度。3.4.11文庫(kù)接頭效率測(cè)定使用AglientTechnologies2100Bioanalyzer儀器對(duì)每個(gè)文庫(kù)進(jìn)行條帶大小確實(shí)定，然后再用KAPA的文庫(kù)定量試劑盒進(jìn)行文庫(kù)接頭效率的測(cè)定，以保證數(shù)據(jù)的精確性。3.5數(shù)據(jù)分析 采用Excel（MicrosoftOfficeExcel）進(jìn)行相對(duì)干物重的計(jì)算，先用t檢查清除偏差值較大的樣本組數(shù)，剩余數(shù)據(jù)求平均值。相對(duì)干物重對(duì)2個(gè)品種的試驗(yàn)組、對(duì)照組的各個(gè)元素含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。按元素分類，計(jì)算均值、原則差，繪制圖表。采用Blast2go3.3軟件對(duì)RNA-seq檢測(cè)到的各品種地上部、根部及根部的mRNA序列文庫(kù)進(jìn)行檢索及注釋。計(jì)算體現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)（Foldchange）。FoldChange=X1~X3是試驗(yàn)組三個(gè)反復(fù)的體現(xiàn)量，日本晴：S1~S3，R1~R3，XZ26：S7~S9，R7~R9Y1~Y3是試驗(yàn)組三個(gè)反復(fù)的體現(xiàn)量，日本晴：S4~S6，R4~R6，XZ26：S10~S12，R10~R12篩選出FDR＜0.001，相對(duì)體現(xiàn)FoldChange＞2或＜0.5的差異體現(xiàn)基因（mRNA序列），將同一基因體現(xiàn)出的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行歸納，合并為單個(gè)基因，列出各品種各部位差異基因表。從差異基因表中選出水稻和大麥中具有高度序列相似性的共同體現(xiàn)基因，再?gòu)闹羞x出在一對(duì)多或多對(duì)一中評(píng)估成績(jī)較高的基因，列出共同差異基因表，以待深入比較分析。4.成果與分析4.1大麥和水稻耐鹽性比較圖1三種鹽濃度處理下大麥與水稻體現(xiàn)型的差異如圖1，與對(duì)照組相比，在100和150mM濃度的NaCl處理?xiàng)l件下，大麥組、水稻組的生長(zhǎng)狀況均受到一定影響。圖1為在鹽處理7d取樣時(shí)，各組的生長(zhǎng)形態(tài)。對(duì)照組水稻生長(zhǎng)狀況良好，葉片正常展現(xiàn)綠色、挺直；對(duì)照組大麥的生長(zhǎng)狀況良好，葉片寬敞茂密，但基部老葉倒伏較嚴(yán)重，部分葉片有發(fā)黃，這與預(yù)期有所不符。在鹽濃度100mM下，大麥總體長(zhǎng)勢(shì)與對(duì)照組相比變化不大，葉片疏密合適，呈綠色，葉寬減??；而水稻組則開始展現(xiàn)一定影響，重要表目前新葉生長(zhǎng)速率減緩，老葉開始發(fā)黃，根系生長(zhǎng)減緩，部分葉片葉尖下垂。150mMNaCl處理下，大麥生長(zhǎng)受到一定影響，但并不明顯，僅生長(zhǎng)速率稍減緩；與之相對(duì)，水稻所有品種的生長(zhǎng)均受到嚴(yán)重影響，從株高來(lái)看，生長(zhǎng)速率緩慢，部分植株基本停止生長(zhǎng)，靠近死亡，葉片窄小、蜷縮萎蔫。 以XZ26和日本晴分別作為大麥、水稻的代表品種，第一次取樣所測(cè)得干物重成果如表2?？梢娗宄趾笈c對(duì)攝影比，XZ26和日本晴在100mM下干物重呈基本不變或減小趨勢(shì)，由相對(duì)干物重可見變化幅度不大，大概在0.75至1.0之間，日本晴根部及XZ26地上部干物重對(duì)鹽處理較為敏感。就整珠而言，高濃度鹽含量時(shí)，XZ26的相對(duì)干物重隨濃度增長(zhǎng)減少更明顯。表2鹽處理前后大麥與水稻根和地上部干物重比較編號(hào)“S”為地上部，“R”為根部，干物重為差異明顯性分析后求求平均所得部位品種處理濃度干物重/g相對(duì)干物重地上部日本晴對(duì)照0.19650.958100mM0.1883XZ26對(duì)照0.15480.815100mM0.1261根部日本晴對(duì)照0.04610.757100mM0.0349XZ26對(duì)照0.04240.892100mM0.03784.2鹽脅迫對(duì)大麥及水稻元素含量的影響 保持離子平衡是大麥的重要耐鹽機(jī)制，也是作物正常生長(zhǎng)的基本要素之一。在大體理解大麥與水稻重要品種的耐鹽性差異后，即可測(cè)定它們對(duì)照組、100mM兩個(gè)鹽濃度水平的地下部和地上部的大量元素K、Ca、Na及微量元素Mg、Mn、Fe、Cu、Zn含量。從圖2和圖3中可以直觀理解鹽脅迫對(duì)大麥及水稻兩個(gè)組織中元素含量的影響，其成果對(duì)該時(shí)期基因組功能及體現(xiàn)量變化等深入研究具有參照價(jià)值。以日本晴和XZ26分別作為水稻和大麥的代表品種，選用鹽處理后7d進(jìn)行測(cè)定。 鹽處理后，日本晴、XZ26地上部、地下部的Na含量均明顯上升，升至對(duì)照組的10-30倍，其中根部XZ26處理前為0.745mg?g-1，與日本晴的0.725mg?g-1靠近，處理后上升至22.24mg?g-1較之日本晴含量更高。而地上部狀況則有所不一樣，處理前日本晴和XZ26分別為0.278mg?g-1與0.284mg?g-1非?？拷?，鹽處理后XZ26上升至33.52mg?g-1遠(yuǎn)低于日本晴的52.18mg?g-1，兩個(gè)品種的變化趨勢(shì)與根部相反，闡明大麥在高鹽環(huán)境下，Na自根部到地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)趨向于受到克制，體現(xiàn)了大麥品種的離子平衡機(jī)制。日本晴、XZ26的地上部、根部在高鹽環(huán)境下，K含量均明顯下降，與Na含量變化展現(xiàn)明顯的負(fù)有關(guān)。其中日本晴根部由39.0mg?g-1降至19.24mg?g-1，為對(duì)照組的49%，降幅最明顯，XZ26由68.10mg?g-1降至52.1mg?g-1，降幅僅23%；地上部日本晴K元素含量?jī)H降至75%，由對(duì)照組的50.83mg?g-1降至38.07mg?g-1，XZ26與之相比，試驗(yàn)組62.76對(duì)比對(duì)照組100.78，降至62%，幅度愈加明顯，闡明高鹽環(huán)境對(duì)K的吸取產(chǎn)生了一定影響，并且日本晴在高鹽環(huán)境下更趨向于將K元素輸送到地上部，而XZ26趨向于保留在根部。兩個(gè)品種的地上部、地下部的Ca含量在鹽處理時(shí)發(fā)生不一樣程度的下降。其中對(duì)處理最不敏感的是日本晴的根部，試驗(yàn)組1.276mg?g-1與對(duì)照組1.152mg?g-1相比降幅10%，而XZ26根部由2.731mg?g-1降至1.802mg?g-1，降幅34%；與之相對(duì)的，地上部日本晴的試驗(yàn)組與對(duì)照組Ca含量分別為3.77mg?g-1與5.36mg?g-1，XZ26分別為3.84mg?g-1與6.21mg?g-1，鹽處理后的Ca積累量?jī)烧呦嘟?，處理前XZ26有稍高的積累量，降幅分別為30%與38%，XZ26降幅僅僅稍不小于日本晴，可見XZ26鈣含量對(duì)鹽處理愈加敏感，而日本晴僅地上部積累量受到較大影響。微量元素方面，最值得關(guān)注的是Fe元素和Cu元素，與其他元素不一樣，它們的根部積累量明顯高于地上部。未進(jìn)行鹽處理時(shí)，日本晴和XZ26根部的Fe積累量分別為0.235mg?g-1和0.822mg?g-1，大麥品種明顯更高，而地上部含量分別為0.0872mg?g-1和0.0875mg?g-1，基本相似；鹽處理時(shí)，日本晴根部和地上部Fe含量均一定程度的上升，分別為0.396mg?g-1和0.112mg?g-1，對(duì)照組的1.66和1.28倍，而XZ26根部和地上部Fe元素均下降，分別為0.642mg?g-1和0.0776mg?g-1，對(duì)照組的78%和89%，變化趨勢(shì)相反。Cu濃度在地上部鹽處理時(shí)均受到克制，日本晴試驗(yàn)組0.0266mg?g-1與對(duì)照組0.0385mg?g-1相比僅為69%，XZ26試驗(yàn)組含量0.0097mg?g-1為對(duì)照組0.0122mg?g-1的80%；鹽處理根部的Cu含量同樣為克制作用，且降幅明顯，試驗(yàn)組0.0316mg?g-1僅為對(duì)照組0.0980mg?g-1的大概1/3，與之相對(duì)，日本晴的Cu含量小幅度上升，試驗(yàn)組0.465mg?g-1是對(duì)照組0.375的1.24倍。Mg含量在鹽處理下變化趨勢(shì)與Ca有所類似，日本晴根部基本未受到影響，100mM下Mg含量1.37mg?g-1與對(duì)照組1.36mg?g-1相比可視為不變，而XZ26也僅受到微小影響，試驗(yàn)組1.15mg?g-1與對(duì)照1.23mg?g-1相比到達(dá)93%；日本晴地上部分別為3.86mg?g-1與5.08mg?g-1，降幅24%，結(jié)合文獻(xiàn)，表明Mg在由地下輸送到地上部時(shí)受到一定影響，XZ26由2.44mg?g-1下降到試驗(yàn)組的2.03mg?g-1，對(duì)應(yīng)降幅17%不小于根部，但不及日本晴變化大。此外，日本晴、XZ26地上部和根部在鹽脅迫下，Mn、Zn含量均發(fā)生不一樣幅度的下降，均為明顯變化。在鹽脅迫條件下，元素Na如此大幅度的上升，據(jù)猜測(cè)重要是由鹽處理所引起，品種特異性的影響次之。資料表明[29]水稻地上部葉片組織代謝對(duì)于Na含量比大麥更為敏感，而本次地上部RNA-seq重要材料就是葉片，印證了取材和分析成果的對(duì)的性。除Na外，元素含量明顯上升的只有日本晴地上部與根部的Fe元素，日本晴地上部的Cu元素，其他均為下降或無(wú)明顯變化?？梢姼啕}環(huán)境對(duì)于水稻和大麥的大量元素吸取具均有明顯的克制作用，不利于生長(zhǎng)發(fā)育；微量元素在鹽脅迫下也許伴隨更復(fù)雜的調(diào)控方式。

根部Mg含量地上部Mg含量圖2鹽處理前后大麥與水稻元素含量差異濃度單位mg?g-1根部Mg含量地上部Mg含量地上部Fe含量根部Fe含量根部Cu含量根部Mn含量根部Zn含量地上部Cu含量地上部Mn含量地上部Zn含量根部Fe含量地上部地上部Fe含量根部Fe含量根部Cu含量根部Mn含量根部Zn含量地上部Cu含量地上部Mn含量地上部Zn含量根部Fe含量地上部Fe含量

4.3鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組分析4.3.1差異體現(xiàn)基因調(diào)控初步分析：通過(guò)之前所分析的生長(zhǎng)外觀表型、金屬元素含量變化等，已經(jīng)能大體理解水稻、大麥代表品種存在一定的耐鹽性差異。而RNA-seq成果表明水稻和大麥大多數(shù)基因在鹽脅迫下進(jìn)行了差異體現(xiàn)，且差異基因的調(diào)控狀況也有所不一樣，重要表目前不一樣品種、不一樣部位的基因上調(diào)或下調(diào)數(shù)目不一樣。如圖3所示[30]，滿足FDR＜0.001，F(xiàn)oldChange＜0.5或FoldChange＞2或具有體現(xiàn)量=0（Foldchange未知）的條件下，共篩選出地上部差異體現(xiàn)基因3371個(gè)，包括XZ26（大麥）187個(gè)，日本晴（水稻）3246個(gè)，地上部共同體現(xiàn)基因62個(gè)。有13和16個(gè)基因分別在所有品種中均上調(diào)和下調(diào)。共有基因中分別有3個(gè)和30個(gè)基因在XZ26中受到上調(diào)和下調(diào)，而在日本晴中調(diào)整方向相反。分別有36個(gè)和89個(gè)基因在日本晴中未被檢測(cè)到，而在XZ26中分別上調(diào)和下調(diào)。有39個(gè)和119個(gè)基因分別僅在XZ26上調(diào)和下調(diào)，由共有差異基因和大麥特有基因的特殊性，初步推測(cè)其中具有耐鹽基因。地上部根部圖3大麥與水稻鹽處理下差異體現(xiàn)基因數(shù)的比較根部差異體現(xiàn)基因5326個(gè)，包括XZ26（大麥）606個(gè)，日本晴（水稻）4919個(gè)，根部共同體現(xiàn)基因199個(gè)。有43和60個(gè)基因分別在所有品種中均上調(diào)和下調(diào)。共有基因中分別有81個(gè)和15個(gè)基因在XZ26中上調(diào)和下調(diào)，而在日本晴中調(diào)整方向相反。分別有260個(gè)和147個(gè)基因在日本晴中未被檢測(cè)到，而在XZ26中分別上調(diào)和下調(diào)。有341個(gè)和162個(gè)基因分別僅在XZ26上調(diào)和下調(diào)。同理猜測(cè)共有及大麥特有基因中有應(yīng)對(duì)鹽脅迫的組員。差異基因越多表明對(duì)鹽脅迫越敏感，根部差異體現(xiàn)基因明顯多于地上部，水稻差異體現(xiàn)基因明顯多于大麥?；蛳抡{(diào)是生理活動(dòng)受到克制的體現(xiàn)，大麥根部基因大多上調(diào)，地上部基因大多下調(diào)，水稻則相反。而非共有基因數(shù)目明顯多于共有基因闡明耐鹽調(diào)控方式不一樣。4.3.2大麥與水稻中共有的鹽脅迫響應(yīng)基因 通過(guò)初步篩選得到地上部（表3）和地下部共有差異基因，結(jié)合Blast2go基因注釋，將其歸入不一樣的基因組，并根據(jù)其注釋的功能與耐鹽性之間的聯(lián)絡(luò)。由于軟件原因，根部基因并未所有獲得注釋，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)一，本試驗(yàn)僅就地上部基因進(jìn)行了分析。蛋白質(zhì)功能類似的基因被歸為1個(gè)基因類。按作用對(duì)象篩分出A、B、C、D、E共5個(gè)基因類別。A類基因中共7個(gè)組員，蛋白具有構(gòu)造域，通過(guò)直接與DNA、RNA結(jié)合的蛋白而直接起到調(diào)控作用，可參與多項(xiàng)生理反應(yīng)。1、2、48號(hào)基因的蛋白屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族，是含高度保守的關(guān)鍵氨基酸序列的質(zhì)膜內(nèi)在蛋白，在受到病原菌、損傷、鹽害等脅迫因子誘導(dǎo)后體現(xiàn)，其鋅指構(gòu)造域能與DNA或RNA結(jié)合，調(diào)控并參與多項(xiàng)生理過(guò)程包括抗病、生長(zhǎng)發(fā)育、修復(fù)損傷等方面[28]。該基因組的這3個(gè)基因在XZ26中均下調(diào)，在日本晴均上調(diào)。16號(hào)的蛋白也在XZ26下調(diào)而在日本晴地上部明顯上調(diào)，其屬于VQ蛋白家族，具有VQ-motif保守序列。此外，35號(hào)鋅指CCCH構(gòu)造域蛋白是轉(zhuǎn)錄遏制物，克制植物色素形成，通過(guò)調(diào)控GA和ABA的體現(xiàn)控制生長(zhǎng)，XZ26和日本晴都上調(diào)。37號(hào)的蛋白屬于螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）DNA構(gòu)造域家族，在兩個(gè)品種中均發(fā)生下調(diào)。B類基因共具有6個(gè)組員，是參與激素合成或調(diào)控的酶。編號(hào)9對(duì)應(yīng)蛋白為9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素加雙氧酶，注釋表明它是植物合成ABA的關(guān)鍵物質(zhì)，在XZ26和日本晴中均上調(diào)，即增進(jìn)ABA合成。編號(hào)27對(duì)應(yīng)合成ACC氧化酶，重要功能是乙烯生物合成途徑的限速酶，調(diào)控乙烯的生成速率，在日本晴和XZ26中體現(xiàn)均下調(diào)[15]。44號(hào)對(duì)應(yīng)合成小麥萌發(fā)素，該類激素與逆境刺激有關(guān)，而文獻(xiàn)[11]表明它是一類重要的脅迫響應(yīng)蛋白，位于細(xì)胞外基質(zhì)，使草酸分解生成H2O2，屬于Cupin超家族組員，該基因在大麥中下調(diào)，水稻未知。49號(hào)參與調(diào)控FERONIA受體激酶，大麥中下調(diào)，水稻未知，該酶能正向調(diào)整生長(zhǎng)素，克制ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及磷酸酶的失活，使植物生長(zhǎng)趨向活躍；50號(hào)為脫落酸受體PYL4，與49號(hào)具有功能相似性，克制ABA及磷酸酶失活，需在生長(zhǎng)受克制等脅迫環(huán)境下體現(xiàn)。57號(hào)為細(xì)胞分裂素-O-糖基轉(zhuǎn)移酶，可以使CTK發(fā)生O-葡萄糖基化而失活，由于可通過(guò)β-葡糖苷恢復(fù)，發(fā)生此類糖基化對(duì)CTK的克制作用影響不大，可防止CTK被降解，便于其運(yùn)送、儲(chǔ)存，該基因大麥下調(diào)，水稻明顯上調(diào)[20]。C類基因共5個(gè)組員，與葉綠體的脂類及色素類調(diào)控有關(guān)的酶。30、33號(hào)基因?qū)?yīng)α-酮戊二酸加雙氧酶，與黃酮素、花青素等的生物合成有關(guān)，均在XZ26下調(diào)，日本晴上調(diào)。40號(hào)基因在XZ26上調(diào)，日本晴明顯上調(diào)，參與脂氧合酶形成；46號(hào)PAP14同樣存在于葉綠體并參與脂質(zhì)形成，它們均在日本晴地上部明顯上調(diào)[25]。62號(hào)對(duì)應(yīng)A1-Igammal磷脂酶，參與葉綠體脂質(zhì)代謝，可水解甘油磷脂、糖脂，在XZ26上調(diào)，日本晴下調(diào)。D類為與金屬元素調(diào)控有關(guān)的酶，共有2個(gè)組員。31號(hào)在XZ26下調(diào)，日本晴上調(diào)，參與合成鈣調(diào)蛋白PBP1，可結(jié)合Ca，增進(jìn)其吸取，并在脅迫反應(yīng)中起調(diào)整作用。47號(hào)為儲(chǔ)鐵蛋白，在葉綠體中，搜集可溶性Fe2+并以Fe3+形式儲(chǔ)存，影響光合作用，也許對(duì)Fe元素平衡有影響，在兩個(gè)品種中均上調(diào)。E類為過(guò)氧化物酶，可催化過(guò)氧化氫、酚類等的分解。包括26號(hào)（XZ26明顯下調(diào)、日本晴明顯上調(diào)）、41號(hào)（XZ26下調(diào)、日本晴上調(diào)）、58號(hào)（XZ26下調(diào)、日本晴明顯上調(diào)）。剩余編號(hào)的有標(biāo)注蛋白或作用于各類蛋白質(zhì)，或作用于無(wú)明確分類的小分子，由于種類繁多，對(duì)它們的功能進(jìn)行深入分類。F類為與免疫調(diào)控有關(guān)的基因組，6個(gè)組員。3、20號(hào)為病程有關(guān)蛋白，與發(fā)病原有關(guān)的一種細(xì)胞外蛋白，具有多種免疫效應(yīng)，XZ26下調(diào)[19]。5號(hào)在兩個(gè)品種均下調(diào)，對(duì)應(yīng)CBL互作激酶，與CBL蛋白結(jié)合，調(diào)整NAF域，使之以Ca依賴方式激活，激活后CBL作用于免疫反應(yīng)[22]。7號(hào)對(duì)應(yīng)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，可以降解入侵真菌的細(xì)胞壁，XZ26下調(diào)，日本晴明顯上調(diào)。17號(hào)對(duì)應(yīng)GPI錨定的賴氨酸構(gòu)造域蛋白，是一種細(xì)胞表面受體，日本晴下調(diào)。51號(hào)對(duì)應(yīng)蛋白可引起作物過(guò)敏反應(yīng)和抗病性，兩個(gè)品種均下調(diào)。G類是位于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)或信號(hào)蛋白，3個(gè)組員。23號(hào)的COBRA-7，離散分布，與纖維素沉積及細(xì)胞的伸長(zhǎng)有關(guān)，在日本晴、XZ26中體現(xiàn)均受克制。2號(hào)ATP與細(xì)胞膜的結(jié)合蛋白，增進(jìn)細(xì)胞膜細(xì)胞骨架上ATP水解酶的催化效率，兩個(gè)品種都上調(diào)。53號(hào)為絲/蘇氨酸激酶受體，跨膜信號(hào)蛋白，接受胞外信號(hào)，使下游信號(hào)中絲/蘇氨酸磷酸化。H類是與逆境脅迫直接有關(guān)的調(diào)控基因，9個(gè)組員。10號(hào)對(duì)應(yīng)海藻糖-磷酸鹽合酶，其體現(xiàn)在XZ26和日本晴分別上調(diào)至2.01和5.00倍。24號(hào)對(duì)應(yīng)油體鈣蛋白，XZ26和日本晴中分別下調(diào)和明顯上調(diào)。43號(hào)對(duì)應(yīng)HVA22，在XZ26和日本晴中分別上調(diào)至2.773和9.109倍。55號(hào)對(duì)應(yīng)線粒體精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，需Cl-誘導(dǎo)下體現(xiàn)，XZ26未知，日本晴明顯上調(diào)至16.80倍。28、36號(hào)對(duì)應(yīng)半胱氨酸受體激酶，應(yīng)對(duì)脅迫、調(diào)控生長(zhǎng)過(guò)程的保守信號(hào)組件，與病原體防御及細(xì)胞程序性死亡有關(guān)，兩個(gè)基因在XZ26與日本晴中均下調(diào)[24]。29、60號(hào)對(duì)應(yīng)胰蛋白酶克制劑，能結(jié)合胰蛋白克制底物分解，會(huì)在高鹽等逆境下誘導(dǎo)體現(xiàn)，增長(zhǎng)糖分積累，均在XZ26下調(diào)，水稻上調(diào)。此外尚有之前提到的44號(hào)。除以上分類，某些對(duì)應(yīng)各類參與氧化、水解、羧化等生化酶的基因被單獨(dú)列出。6號(hào)α-半乳糖苷水解酶，兩個(gè)品種均上調(diào)。12號(hào)枯草桿菌蛋白水解酶，XZ26下調(diào)。13號(hào)含黃素單氧酶，與含N、S、P、Se等親和雜原子化合物的化學(xué)異物氧化代謝有關(guān)，XZ26下調(diào)，日本晴明顯上調(diào)。14號(hào)對(duì)應(yīng)多胺氧化酶降解多胺，均下調(diào)。15號(hào)磺基轉(zhuǎn)移酶，結(jié)合磷酸鹽與外源化合物或代謝產(chǎn)物，調(diào)控解毒、生長(zhǎng)發(fā)育，保持黃酮化合物多樣性，XZ26上調(diào)，日本晴下調(diào)[21]。18號(hào)HAD家族水解酶，XZ26下調(diào)，日本晴上調(diào)。39號(hào)對(duì)應(yīng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，XZ26下調(diào)，日本晴明顯上調(diào)，TCA循環(huán)中依賴Ca催化形成草酰乙酸。45號(hào)基因體現(xiàn)的阿魏酰輔酶A為轉(zhuǎn)移酶，將阿魏?；D(zhuǎn)移至羥基棕櫚酸上形成酸酐，缺水環(huán)境下的組分存貯，兩個(gè)品種均下調(diào)；而同對(duì)應(yīng)酰基轉(zhuǎn)移酶的56號(hào)兩個(gè)品種均上調(diào)。59號(hào)對(duì)應(yīng)的1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶，催化3-磷酸甘油醛產(chǎn)生1-脫氧木酮糖-5-磷酸和丙酮酸的酮醇縮合反應(yīng)生成DXP，是一種質(zhì)體類異戊二烯生物合成必需的限制酶，和葉綠體的發(fā)育親密有關(guān)，該基因在XZ26中下調(diào)，而在日本晴中明顯上調(diào)至70.4倍。61對(duì)應(yīng)β-1-3內(nèi)切葡聚糖水解酶，水解可溶性纖維素，兩個(gè)品種均下調(diào)。此外尚有某些功能不夠明晰的基因。8號(hào)屬于cupin超家族組員，在日本晴、XZ26中分別下調(diào)、上調(diào)，同屬該家族的尚有9、30、44號(hào)，調(diào)控方式各不相似。19號(hào)調(diào)控某種合成克制劑，54號(hào)調(diào)控某種糖激酶，它們都在XZ26中下調(diào)，日本晴中上調(diào)。而4、11、21、25號(hào)等基因無(wú)注釋，功能有待探明。

表3大麥（左）與水稻（右）地上部鹽處理共同差異基因體現(xiàn)量變化及其調(diào)控蛋白No.基因MSUfoldchangeblast2go注釋基因MSUfoldchangeblast2go注釋1MLOC_102640.252probableWRKYtranscriptionfactor50LOC_Os05g460208.402probableWRKYtranscriptionfactor502MLOC_120790.255WRKYDNA-bindingdomainsuperfamilyLOC_Os01g402609.056WRKYtranscriptionfactor28-like3MLOC_125810.278pathogenesis-related1-17LOC_Os05g51680?pathogenesis-related1A-like4MLOC_140090.411predictedproteinLOC_Os01g486200.071---NA---5MLOC_158340.435CBL-interactingkinase21LOC_Os07g442900.293CBL-interactingkinase216MLOC_15872.478alpha-galactosidaseLOC_Os10g351107.068alpha-galactosidase7MLOC_163200.126endochitinaseLOC_Os06g5106028.679endochitinase8MLOC_1695018.027---NA---LOC_Os08g134400.179germintype19MLOC_183002.799---NA---LOC_Os03g443807.8509-cis-epoxycarotenoiddioxygenase10MLOC_187252.011probablealpha,alpha-trehalose-phosphatesynthase[UDP-forming]9LOC_Os02g548204.996probablealpha,alpha-trehalose-phosphatesynthase[UDP-forming]911MLOC_207470.492Rpr4901.2LOC_Os11g119800.371Os11g0227000,partial12MLOC_365290.414Subtilisin-likeproteaseLOC_Os04g03100?subtilisin-likeprotease13MLOC_368490.306probableflavin-containingmonooxygenase1LOC_Os04g1469065.590probableflavin-containingmonooxygenase114MLOC_373280.334probablepolyamineoxidase4LOC_Os04g575600.452probablepolyamineoxidase415MLOC_392353.716flavonolsulfotransferase-likeLOC_Os11g309100.249cytosolicsulfotransferase8-likeisoformX316MLOC_402540.407VQmotiffamilyLOC_Os06g3397030.225VQmotiffamily17MLOC_43178?lysMdomain-containingGPI-anchored1-likeLOC_Os09g278900.207lysMdomain-containingGPI-anchored1-like18MLOC_45180.440catalytichydrolaseLOC_Os03g494408.960HAD-superfamilyhydrolase,subfamilyIA,variant3,19MLOC_484290.132synthesisinhibitorIILOC_Os01g073005.361synthesisinhibitorII20MLOC_485310.277Pathogenesis-related1LOC_Os01g284505.933pathogenesis-relatedmaizeseed21MLOC_509710.303hypotheticalproteinTRIUR3_04936LOC_Os02g534105.751PREDICTED:uncharacterizedproteinLOC433088722MLOC_51830.468Pleiotropicdrugresistance4LOC_Os01g424105.957ABCtransporterGfamilymember3723MLOC_528640.391COBRA7LOC_Os07g490800.265COBRA724MLOC_529300.147caleosin2LOC_Os04g4320029.345caleosin225MLOC_536213.096predictedproteinLOC_Os04g4714011.782PREDICTED:uncharacterizedproteinLOC433664026MLOC_541290.078peroxidaseN-likeLOC_Os10g0207010.602peroxidaseN-like27MLOC_542720.361ACCoxidaseLOC_Os09g277500.2551-aminocyclopropane-1-carboxylateoxidase128MLOC_552070.175cysteine-richreceptorkinase10LOC_Os10g047200.225cysteine-richreceptorkinase1029MLOC_56460.350Bowman-BirktypetrypsininhibitorLOC_Os03g608408.734Bowman-Birktypetrypsininhibitor-like30MLOC_595960.421Naringenin,2-oxoglutarate3-dioxygenaseLOC_Os03g030345.444naringenin,2-oxoglutarate3-dioxygenase-like31MLOC_603120.258calcium-bindingPBP1-likeLOC_Os06g469505.132calcium-bindingPBP1-like32MLOC_605170.327---NA---LOC_Os11g02250?---NA---33MLOC_614970.277naringenin,2-oxoglutarate3-dioxygenase-likeLOC_Os04g491940.363naringenin,2-oxoglutarate3-dioxygenase-like34MLOC_632752.323glutamatedecarboxylaseLOC_Os03g133007.463glutamatedecarboxylase135MLOC_635252.921zincfingerCCCHdomain-containing2-likeLOC_Os05g106709.270nucleicacidbinding續(xù)表3大麥（左）與水稻（右）地上部鹽處理共同差異基因體現(xiàn)量變化及調(diào)控蛋白No.基因MSUfoldchangeblast2go注釋基因MSUfoldchangeblast2go注釋36MLOC_641640.451Lectin-domaincontainingreceptorkinaseLOC_Os09g169500.031---NA---37MLOC_64470.374HLHDNA-bindingdomainsuperfamilyLOC_Os02g451700.346HLHDNA-bindingdomainsuperfamily38MLOC_644750.290---NA---LOC_Os01g0673028.516receptor1239MLOC_647240.381phosphoenolpyruvatecarboxylasekinaseLOC_Os02g4158023.715phosphoenolpyruvatecarboxylasekinase40MLOC_649726.511？LOC_Os12g3726023.255lipoxygenase,chloroplastic41MLOC_652260.276rootperoxidaseLOC_Os07g480205.696peroxidase2-like42MLOC_652882.211predictedproteinLOC_Os09g0857052.887ribosomal-like43MLOC_670972.773HVA22eLOC_Os11g305009.109HVA22e44MLOC_674380.322Germin3-7LOC_Os03g59010?germin3-845MLOC_677520.399omega-hydroxypalmitateO-feruloyltransferase-likeLOC_Os11g424800.261agmatinecoumaroyltransferase46MLOC_688850.446probableplastid-lipid-associated14,chloroplasticLOC_Os01g4672028.431probableplastid-lipid-associated14,chloroplastic47MLOC_692953.315Ferritin-1,chloroplasticLOC_Os12g015304.314ferritin-1,chloroplastic48MLOC_701900.329WRKYtranscriptionfactor40LOC_Os06g4401010.132probableWRKYtranscriptionfactor6049MLOC_711250.400ReceptorkinaseFERONIALOC_Os05g25370?receptorkinaseFERONIA50MLOC_713490.337abscisicacidreceptorPYL4LOC_Os03g186000.198abscisicacidreceptorPYL4-like51MLOC_732030.332Harpin-induced1containing,expressedLOC_Os12g062200.359Harpin-induced1containing,expressed52MLOC_732082.685EHdomain-containing1LOC_Os04g5735019.957EHdomain-containing1-like53MLOC_737720.243serinethreonine-kinasereceptorLOC_Os04g013104.719---NA---54MLOC_747130.460uncharacterizedsugarkinaseslr0537LOC_Os01g016203.372uncharacterizedsugarkinaseslr053755MLOC_74725?mitochondrialargininetransporterBAC2LOC_Os01g1252016.800mitochondrialargininetransporterBAC256MLOC_751546.906acyltransferaseAt1g54570,chloroplasticLOC_Os09g335309.789acyltransferaseAt1g54570,chloroplastic57MLOC_764800.198Cytokinin-O-glucosyltransferase2LOC_Os02g5193028.456Cytokinin-O-glucosyltransferase258MLOC_791760.216Peroxidase2LOC_Os07g4801013.478peroxidase2-like59MLOC_800270.174probable1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase2,chloroplasticLOC_Os07g0919070.248probable1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase2,chloroplastic60MLOC_804760.393Bowman-Birktypewound-inducedproteaseinhibitorLOC_Os01g04040?wound-inducedserineproteaseinhibitor61MLOC_808490.235beta-1,3-endoglucanase,partialLOC_Os01g713500.326beta-1,3-glucanaseprecursor62MLOC_808784.456phospholipaseA1-Igamma1,chloroplastic-likeLOC_Os05g323800.234phospholipaseA1-Igamma1,chloroplastic-like4.3.3大麥中特有的鹽脅迫響應(yīng)基因 除共有差異體現(xiàn)基因外，大量差異基因僅在水稻或大麥中存在。水稻和大麥分化以來(lái)不一樣環(huán)境的長(zhǎng)期選擇下，大麥中必然保留某些特有的基因及其體現(xiàn)調(diào)控，它們同樣為提高大麥的耐鹽性做出了奉獻(xiàn)。所有檢測(cè)出的大麥特有的響應(yīng)鹽脅迫的基因共125個(gè)，如表4所示。它們從離子平衡、氧化、可溶物滲透等不一樣途徑進(jìn)行調(diào)控，根據(jù)功能不一樣，可以篩選出某些推測(cè)的關(guān)鍵耐鹽基因組并分類。表4大麥特有的鹽脅迫響應(yīng)基因體現(xiàn)量變化及其調(diào)控蛋白基因MSUfoldchangeblast2go注釋基因MSUfoldchangeblast2go注釋MLOC_580640.4413-N-debenzoyl-2-deoxytaxolN-benzoyltransferase-likeMLOC_641920.260glucosyltransferaseMLOC_733800.2337-deoxyloganetinglucosyltransferase-likeMLOC_770793.383Glucosyltransferase,,expressedMLOC_526980.404ABCtransporterGfamilymember28-likeMLOC_233676.734Glutaredoxin-C1MLOC_107480.314ABCtransporterGfamilymember37MLOC_587894.996Glutaredoxin-C1MLOC_565710.102ABCtransporterGfamilymember6-likeMLOC_580410.431glycerophosphodiesterphosphodiesteraseGDPD6MLOC_60739?abscisicacidreceptorPYL4-likeMLOC_776900.337GTP-bindingSAR1AMLOC_590190.387agmatinecoumaroyltransferaseMLOC_56390.455heatshock70kDa17MLOC_145022.291aminoacidtransportMLOC_112860.356heatstresstranscriptionfactorA-4d-likeMLOC_649670.437Asparticasenepenthesin-2MLOC_74263?hypotheticalproteinF775_03829MLOC_592270.467BluecopperMLOC_787450.057hypotheticalproteinF775_03829MLOC_209013.152BTBPOZdomain-containing,partialMLOC_29100.040hypotheticalproteinF775_20921MLOC_639262.062BTBPOZdomain-containingAt3g05675-likeMLOC_617680.428hypotheticalproteinF775_32425MLOC_20.466bZIPtranscriptionfactor60MLOC_3958511.752invertaseinhibitorMLOC_646852.813C-4methylsteroloxidaseMLOC_147870.362IQdomain-containingIQM1MLOC_442470.337caffeoylshikimateesterase-likeisoformX1MLOC_513930.258isoflavonereductaseMLOC_50.408CBL-interactingkinase14MLOC_600220.281L-ascorbateoxidase-likeMLOC_729290.386cellnumberregulator13-likeMLOC_810030.496light-inducibleCPRF2-likeisoformX2MLOC_118750.452ceramideglucosyltransferaseMLOC_642020.349longchainacyl-synthetase4-likeMLOC_547622.119chloridechannelCLC-c-likeMLOC_666300.436L-typelectin-domaincontainingreceptorkinase-likeMLOC_77020.381cysteine-richreceptorkinase19MLOC_565070.353MLO1MLOC_232210.365cysteine-richreceptorkinase25MLOC_115480.469NADP-dependentmalicenzymeMLOC_719580.356cytochromeP450711A1MLOC_533630.211NRT1PTRFAMILY-likeMLOC_673190.434DSBA-likethioredoxindomaincontainingMLOC_593820.400NUCLEARFUSIONDEFECTIVE4-likeMLOC_650560.259E3ubiquitin-ligaseEL5-likeMLOC_61322.369OTUdomain-containingAt3g57810MLOC_662980.329endoglucanase7MLOC_631250.412pathogenesis-related1-14MLOC_136180.228ent-kaur-16-enesynthase,chloroplastic-likeMLOC_729650.265pathogenesis-related1-16MLOC_668435.464ethylene-responsivetranscriptionfactor12-likeMLOC_564710.387pentatricopeptiderepeat-containingAt1g26900,mitochondrialMLOC_432070.307Ethylene-responsivetranscriptionfactor1BMLOC_363383.327pentatricopeptiderepeat-containingAt3g29290MLOC_374922.242F-boxLRR-repeat13MLOC_662542.489pentatricopeptiderepeat-containingAt5g39980,chloroplasticMLOC_724894.935F-boxLRR-repeat3-likeMLOC_559803.303pentatricopeptiderepeat-containingAt5g46580,chloroplasticMLOC_445488.662F-boxLRR-repeatAt4g14096MLOC_70399?PeroxidaseNMLOC_572840.498ferredoxin,rootR-B1-likeMLOC_345710.198Phenylalanineammonia-lyaseMLOC_446300.369floralorganregulator1,partialMLOC_511282.766phosphoenolpyruvatecarboxykinase[ATP]-likeMLOC_45890.475GDSLesteraselipaseAt5g45910-likeMLOC_382910.134postacrosomalsheathWWdomain-binding-likeMLOC_257630.393Glucan1,3-beta-glucosidaseMLOC_119600.237PR17cprecursor續(xù)表4大麥特有的鹽脅迫響應(yīng)基因體現(xiàn)量變化及其調(diào)控蛋白基因MSUfoldchangeblast2go注釋基因MSUfoldchangeblast2go注釋MLOC_672130.418prolineoxidaseMLOC_793350.306probablebeta-1,3-galactosyltransferase19MLOC_384000.348ReceptorkinaseHSL1MLOC_124522.669RNApolymerasesigmafactorsigCMLOC_615792.987probablecalcium-bindingCML22MLOC_748012.029RNA-bindingpno1-likeMLOC_648060.426probableglucuronosyltransferaseOs01g0926700MLOC_556630.207rootperoxidaseMLOC_719483.531probablelinoleate9S-lipoxygenase5isoformX1MLOC_652250.199rootperoxidaseMLOC_712754.435probablelinoleate9S-lipoxygenase5isoformX2MLOC_383672.105rootpimordiumdefective1MLOC_545012.577probablepolygalacturonaseAt1g80170MLOC_752230.470RPM1-interacting4-likeMLOC_678510.392probableWRKYtranscriptionfactor33MLOC_367352.305superoxidedismutase[Fe]2,chloroplasticMLOC_811310.346probableWRKYtranscriptionfactor50MLOC_615850.295sigmafactorbinding1,chloroplastic-likeMLOC_358280.353PREDICTED:uncharacterizedproteinLOCMLOC_721570.436somaticembryogenesisreceptorkinase2-likeisoformX1MLOC_508392.721uncharacterizedLOCisoformX1MLOC_368860.407two-componentresponseregulatorARR3-likeMLOC_509682.427uncharacterizedtransporterYB