‘鳳丹’牡丹PoERF113基因的克隆及表達分析

‘鳳丹’牡丹PoERF113基因的克隆及表達分析

魏禎禎，宋程威，郭麗麗，郭琪，侯小改‘鳳丹’牡丹基因的克隆及表達分析魏禎禎，宋程威，郭麗麗，郭琪，侯小改*(河南科技大學農(nóng)學院，河南洛陽471023)為克隆‘鳳丹’()花瓣衰老相關(guān)基因的序列，分析其編碼蛋白性質(zhì)，探索其在不同發(fā)育時期花瓣、不同組織和不同品種的表達模式及對乙烯的響應，采用RT–PCR技術(shù)，從‘鳳丹’牡丹中克隆到花瓣衰老相關(guān)基因。該基因?qū)儆贏P2/ERF家族，其開放閱讀框(ORF)為636bp，編碼1個由211個氨基酸殘基組成的蛋白，含有1個AP2保守結(jié)構(gòu)域，不包含跨膜結(jié)構(gòu)，蛋白相對分子質(zhì)量約為53000，理論等電點(pI)為5.13，為不穩(wěn)定蛋白，具有親水性；qRT–PCR分析結(jié)果表明，基因在露色期、初開期、半開期、盛開期、始衰期、衰敗期均有表達，主要在‘鳳丹’露色期的花瓣和葉片中表達；在早花‘鳳丹’突變株系中表達量最高；基因在早花‘鳳丹’突變株系與‘鳳丹’中的序列相同，不存在堿基差異；基因?qū)σ蚁┯许憫?，其表達量隨處理時間和生育進程的延長呈逐漸升高的趨勢，推測該基因可能與乙烯誘導后導致花衰老進程相關(guān)?！P丹’牡丹；；基因克??；表達分析基因?qū)儆贏P2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族ERF亞家族的B4類，編碼的蛋白含有1個由58個基因組成的保守AP2結(jié)構(gòu)域，在抵抗大豆疫霉、抵御非生物脅迫、調(diào)節(jié)花衰老、促進愈傷組織形成和根生長等植物發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[1–3]。KHASKHELI等[4]在玫瑰中發(fā)現(xiàn)基因的表達受乙烯誘導，在萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊等大多數(shù)花器官的衰老過程中表達量上調(diào)，采用VIGS技術(shù)使基因沉默，加速了玫瑰花的衰老，并且在花衰老過程中細胞分裂素含量呈降低的趨勢，與細胞分裂素有關(guān)9個基因()，()，，()，，()，，()和的表達水平也隨之降低，但這種衰老過程可以通過外源細胞分裂素處理得到恢復。牡丹(Andr.)是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬()植物，原產(chǎn)于中國，是傳統(tǒng)觀賞植物，被廣泛栽植，觀賞價值高，市場需求量大[5–6]。目前關(guān)于牡丹花期調(diào)控的研究多注重于通過栽培、生長調(diào)節(jié)劑等手段延長花期，對其分子機制的研究不多[7–10]。本研究以‘鳳丹’花瓣為試驗材料，克隆獲得‘鳳丹’基因序列，采用生物信息學技術(shù)對PoERF113蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)等進行預測分析，運用實時熒光PCR技術(shù)研究基因的時空表達模式與不同花期、不同組織和不同品種的相關(guān)性及對乙烯的響應，并對基因在早花‘鳳丹’突變株系與‘鳳丹’中的基因序列進行比對，以期為后續(xù)基因的相關(guān)功能研究提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1植物材料九年生早花‘鳳丹’種植于河南科技大學實驗園區(qū)內(nèi)；早花‘鳳丹’突變株系種植于洛陽隋唐植物園；晚花‘蓮鶴’種植于洛陽國際牡丹園。1.2試驗方法1.2.1總RNA提取及cDNA的合成取‘鳳丹’葉片、莖、花萼和不同時期(露色期、初開期、半開期、盛開期、始衰期、衰敗期)的花瓣和用10mg/L外源乙烯整株噴施圓桃期‘鳳丹’后第1、2、4、8天的花瓣以及早花‘鳳丹’突變株系、‘蓮鶴’半開期的花瓣，采用天根RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)完成總RNA的提??；采用PrimeScript?II1stStrandcDNASynthesisKit獲取cDNA。1.2.2‘鳳丹’基因的克隆從前期得到的‘鳳丹’三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出基因序列，利用PrimerPremier5.0設計基因克隆及實時熒光定量PCR特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。50μLPCR擴增體系包括2μLcDNA模板、1μLTransStartFastPfuDNAPolymerase、10μL5×TransStartFastPfuBuffer、4μLdNTPMixture(2.5mmol/L)、2μL引物–F和2μL–R(10μmol/L)、29μLddH2O。反應程序為95℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，33個循環(huán)；72℃延伸7min?；騊CR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，與pMD18–TVector載體連接后轉(zhuǎn)至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中，利用M13引物進行普通PCR檢測，篩選出陽性單克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。表1PoERF113基因克隆及qRT–PCR分析引物1.2.3‘鳳丹’基因生物信息學分析利用Translate(/translate/)對基因推導的氨基酸序列進行分析；根據(jù)基因的開放閱讀框(openreadingframe，ORF)，運用ProtParam(/protparam/)分析PoERF113蛋白特性理化性質(zhì)；運用在線軟件(/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析PoERF113蛋白保守結(jié)構(gòu)域；運用Protscale(/protscale/)分析PoERF113蛋白親疏水性；運用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析PoERF113蛋白磷酸化位點；運用TMHHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM–2.0/)分析PoERF113蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；運用SPOMA(https://npsa–prabi.ibcp.fr/cgi–bin/secpred_sopma.pl)和SWISS–MODEL(https:///interactive)預測蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。1.2.4基因的表達模式分析根據(jù)測序所得的基因的ORF序列，通過PrimerPremier5.0設計特異性引物，進行qRT–PCR試驗。以基因為內(nèi)參基因，使用寶生物工程(大連)有限公司的實時熒光定量試劑盒(TBGreenTMPremixExTaqII)檢測基因的表達量，每個樣品設置3個生物學重復。1.2.5數(shù)據(jù)分析采用2–ΔΔCt法計算基因的相對表達量[11]；運用Excel2010進行數(shù)據(jù)整理與分析；運用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析；運用Origin8.0繪圖。2結(jié)果與分析2.1‘鳳丹’PoERF113基因的克隆及推導的氨基酸序列提取‘鳳丹’花瓣的總RNA，經(jīng)凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示條帶明亮、清晰，28S帶的亮度約為18S帶亮度的1.5～2.0倍，RNA質(zhì)量較好(圖1)。MDL2000DNAMarker；1總RNA。以‘鳳丹’花瓣為材料提取花瓣組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，利用特異性引物PoERF113–F和PoERF113–R進行擴增，凝膠電泳檢測結(jié)果(圖2)顯示：在約750bp處發(fā)現(xiàn)1條清晰的特異性條帶，與目的片段預測條帶大小一致，該基因長706bp。通過NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)在線工具對其包含的開放閱讀框進行分析，ORF為636bp，編碼211個氨基酸殘基，ORF序列及推導的氨基酸序列如圖3所示。MDL2000DNAMarker；1PoERF113基因。圖3‘鳳丹’PoERF113基因推導的氨基酸序列2.2‘鳳丹’PoERF113蛋白的預測分析2.2.1‘鳳丹’PoERF113蛋白特性分析及保守結(jié)構(gòu)域預測利用ProtParam對候選基因進行蛋白特性分析，結(jié)果表明該蛋白的相對分子質(zhì)量為53000，理論等電點(pI)為5.13，脂肪系數(shù)為28.93，不穩(wěn)定系數(shù)為52.83，大于40，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。利用NCBI中CDD(cyclicdelaydiversity，循環(huán)延遲分集)保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫對PoERF113蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域預測。結(jié)果(圖4)表明，該基因編碼的蛋白具有AP2超家族結(jié)構(gòu)域和特殊的DNA結(jié)合位點，屬于AP2家族一員。圖4PoERF113基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果2.2.2‘鳳丹’PoERF113蛋白親/疏水性預測和跨膜結(jié)構(gòu)域分析運用Protscale對PoERF113蛋白進行親疏水性分析，結(jié)果(圖5)顯示，疏水氨基酸(正值)少于親水氨基酸(負值)，表明該蛋白為親水性蛋白。圖5PoERF113蛋白親疏水性預測分析結(jié)果通過TMHMM對基因進行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果(圖6)表明，該基因編碼蛋白的1～231位氨基酸定位于細胞膜表面，推測PoERF113蛋白可能不包含跨膜結(jié)構(gòu)。圖6PoERF113蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果2.2.3‘鳳丹’PoERF113蛋白磷酸化位點分析磷酸化主要集中在Tyr(酪氨酸)、Ser(絲氨酸)、Thr(蘇氨酸)殘基上，這些殘基上具有游離的羥基，且本身不帶電荷，磷酸化后的蛋白質(zhì)具有電荷，引起結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)活性的變化。NetPhos預測結(jié)果(圖7)表明，基因編碼的氨基酸序列中有19個Ser位點、10個Thr位點、4個Tyr位點。圖7PoERF113蛋白磷酸化位點分析結(jié)果2.2.4‘鳳丹’PoERF113蛋白高級結(jié)構(gòu)預測分析運用SOPMA預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖8)顯示，PoERF113蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)中α–螺旋包含54個氨基酸，延伸鏈包含29個氨基酸，β–轉(zhuǎn)角包含12個氨基酸，無規(guī)則卷曲包含116個氨基酸。如圖9所示，PoERF113蛋白的三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果保持一致。圖8PoERF113蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果圖9PoERF113蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果2.3‘鳳丹’PoERF113蛋白系統(tǒng)進化樹分析將基因的氨基酸序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中，采用bBLASTx算法，選擇10條同源性較高的氨基酸序列進行多序列比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，這10條序列分別為美國山核桃(，KAG2678378.1)，楊梅(，KAB1217539.1)，大葉櫟(，XP030937739.1)，蘋果(，XP017183622.1)，非洲相思子(，XP027360534.1)，葡萄(，CBI15759.3)，藤堤(，XP034672620.1)，南瓜(，XP021622666.1)，菠菜(，XP021844726.1)，藜麥(，XP021731943.1)，利用MEGAX軟件分析‘鳳丹’牡丹基因與其他物種的進化關(guān)系，比對結(jié)果如圖10所示。從圖10可以看出，‘鳳丹’基因與南瓜、菠菜、葡萄的親緣關(guān)系較近，與美國山核桃、楊梅等植物親緣關(guān)系較遠。圖10‘鳳丹’PoERF113蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果2.4‘鳳丹’PoERF113基因表達模式分析為確定基因在‘鳳丹’牡丹花發(fā)育不同時期花瓣中的表達情況，利用熒光定量PCR技術(shù)，以基因為內(nèi)參基因，測定其在露色期、初開期、半開期、盛開期、始衰期、衰敗期花瓣的相對表達量。結(jié)果(圖11)表明，基因在‘鳳丹’牡丹各個花發(fā)育階段中均有表達，且不同花期的相對表達量存在差異。在露色期花瓣的相對表達量最高，初開期花瓣中的相對表達量最低。柱上不同字母示處理間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。為分析基因在組織中的表達模式，選取同時期葉片、莖、花萼和花瓣進行qRT–PCR，以‘鳳丹’牡丹的花瓣為對照。結(jié)果(圖12)表明，基因在‘鳳丹’葉片、莖、花萼和花瓣中均有表達，在‘鳳丹’葉片的基因的表達量極顯著高于莖、花萼和花瓣中的表達量，說明基因主要在葉片中表達。柱上不同字母示處理間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。為明確基因的表達特性，利用qRT–PCR技術(shù)對早花‘鳳丹’突變株系、早花‘鳳丹’和晚花‘蓮鶴’中基因的表達進行分析。結(jié)果(圖13)表明，基因在早花‘鳳丹’、晚花‘蓮鶴’的花瓣中均有表達。在早花‘鳳丹’突變株系的相對表達量最高，約為‘鳳丹’的相對表達量的4.88倍，約為‘蓮鶴’的相對表達量的6.54倍。柱上不同字母示處理間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。采用10mg/L的外源乙烯處理‘鳳丹’牡丹花瓣，發(fā)現(xiàn)基因的表達量隨處理時間的延長逐漸上升(圖14)，且表達量存在顯著差異性?；蛟谔幚淼?天時相對表達量最高，約為處理第1天的10倍，表明基因能被乙烯誘導表達，推測基因可能參與了乙烯信號傳導途徑。柱上不同字母示處理間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.5早花‘鳳丹’突變株系及‘鳳丹’PoERF113基因序列比對為進一步探究基因在花期調(diào)控中的功能，以早花‘鳳丹’突變體花瓣cDNA為模板，采用相同的引物與擴增條件進行RT–PCR擴增，利用DNAMAN6.0對基因在自然狀態(tài)下‘鳳丹’和早花‘鳳丹’突變株系中的序列進行比對。結(jié)果表明，早花‘鳳丹’突變株系基因與‘鳳丹’的序列不存在差異，2條序列的ORF框完全相同。3結(jié)論與討論APETALA2/ERF(Apetala2/Ethylene–responsivefactor，AP2/ERF)轉(zhuǎn)錄因子家族作為最早被鑒定與乙烯響應基因相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，且在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮著不同的功能[12–14]。研究人員在擬南芥、桃、蘋果等多種植物進行了全基因組的鑒定及相應功能的研究，在擬南芥中鑒定出122個AP2/ERF家族成員[15]，在桃中鑒定出131個AP2/ERF家族成員[16]，在蘋果中鑒定出259個AP2/ERF家族成員[17]，在柑橘中鑒定出126個AP2/ERF家族成員[18]。本研究通過克隆得到‘鳳丹’牡丹基因，并對該基因編碼的氨基酸序列進行了一系列生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆贏P2/ERF家族，編碼蛋白含有1個AP2保守結(jié)構(gòu)域，不包含跨膜結(jié)構(gòu)，為不穩(wěn)定蛋白，與易萍等[19]鑒定出的芒果基因特征相符?；蛟诼渡?、初開期、半開期、盛開期、始衰期、衰敗期均有表達，但主要在露色期的花瓣中表達，與玫瑰基因在開花的第五個階段(花朵完全綻放)表達量達到高峰的表達模式不同[4]。前人研究結(jié)果表明，同源基因在不同物種中的時空表達既有共性又有差異。蜻蜓鳳梨基因在外葉、心葉、莖、根中均有表達，但表達量較低，成熟的根中的表達量高于幼根，在花器官中表達量維持在較低水平[20]。本試驗結(jié)果顯示，基因在‘鳳丹’的葉片、花瓣、莖、萼片中均有表達，在葉片中的相對表達量最高，在莖中的相對表達量最低，這暗示基因可能主要調(diào)控葉片的生長發(fā)育?；ㄋダ鲜且粋€高度程序化的過程，由多方面因素共同作用，伴隨著植物體內(nèi)內(nèi)源激素、自由基代謝、細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)解體和膜系統(tǒng)的降解等一系列生理生化過程[21]。植物激素可以調(diào)節(jié)植物開花進程，乙烯、茉莉酸和脫落酸作為植物花衰老促進劑，生長素和細胞分裂素類激素發(fā)揮抑制花衰老的作用[22]。乙烯在植物生長和衰老中起重要作用，在花衰老期間，乙烯的積累成為促進植物衰老的關(guān)鍵步驟[23]。研究表明，外源乙烯處理‘洛陽紅’切花可以促進其內(nèi)源乙烯的生成[24]；對于乙烯依賴型植物，內(nèi)源乙烯的生成將導致植物花衰老[25]；對于乙烯不依賴型植物，外源乙烯的應用不會引導其產(chǎn)生大量的內(nèi)源乙烯，但也可以促進花衰老[26]。研究表明，擬南芥、蜻蜓鳳梨等多個物種的同源基因均響應乙烯處理。外源乙烯處理6～24h內(nèi)，擬南芥基因表達量呈逐漸上升的趨勢[2]。外源乙烯處理1h后，蜻蜓鳳梨基因在幼株和成株外葉、心葉、莖中表達量上升，響應乙烯誘導[20]。本研究中用乙烯噴施‘鳳丹’植株，基因?qū)σ蚁┯兴憫?，處理后，基因表達量升高，這與AGUSTí等[27]在柑橘()中的研究結(jié)果類似。推測該基因可能與乙烯誘導后導致花衰老進程相關(guān)。[1]KONGXP，TIANHY，YUQQ，etal．PHB3maintainsrootstemcellnicheidentitythroughROS-responsiveAP2/ERFtranscriptionfactorsin[J]．CellReports，2018，22(5)：1350–1363．[2]KRISHNASWAMYS，VERMAS，RAHMANMH，etal．FunctionalcharacterizationoffourAPETALA2-familygenes(RAP2．6，RAP2．6L，DREB19andDREB26)in[J]．PlantMolecularBiology，2011，75(1/2)：107–127．[3]SUNF，LIUPQ，XUJ，etal．MutationinRAP2．6L，atransactivatoroftheERFtranscriptionfactorfamily，enhancesresistanceto[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology，2010，74(5/6)：295–302．[4]KHASKHELIAJ，AHMEDW，MAC，etal．RhERF113functionsinethylene-inducedpetalsenescencebymodulatingcytokinincontentinrose[J]．PlantandCellPhysiology，2018，59(12)：2442–2451．[5]李嘉玨．中國牡丹起源的研究[J]．北京林業(yè)大學學報，1998，20(2)：22–26．[6]洪德元，潘開玉．芍藥屬牡丹組的分類歷史和分類處理[J]．植物分類學報，1999，37(4)：351–368．[7]李婷婷，薛璟祺，王順利，等．秋發(fā)牡丹遠緣雜交新材料篩選及系統(tǒng)優(yōu)化[J]．分子植物育種，2019，17(8)：2761–2768．[8]岳高峰，韓志強，馬俊強，等．不同遮陰處理對牡丹花期及花色品質(zhì)的影響[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學，2020，59(17)：83–86．[9]黃金鋒，陳學湘，劉菲．外源激素對牡丹花期延遲試驗[J]．山東林業(yè)科技，2016，46(6)：22–25．[10]石豐瑞．牡丹長日照途徑關(guān)鍵基因以及其上、下游基因、的克隆與表達分析[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2013．[11]LIVAKKJ，SCHMITTGENTD．Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2?ΔΔCtmethod[J]．Methods，2001，25(4)：402–408．[12]DUBOUZETJG，SAKUMAY，ITOY，etal．genesinrice，L.，encodetranscriptionactivatorsthatfunctionindrought-，high-salt-andcold-responsivegeneexpression[J]．Plant&CellPhysiology，2003，33(4)：751–763．[13]MIZOIJ，SHINOZAKIK，YAMAGUCHI-SHINOZAKIK.AP2/ERFfamilytranscriptionfactorsinplantabioticstressresponses[J]．BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-GeneRegulatoryMechanisms，2012，1819(2)：86–96．[14]GUYQ，YANGC，THARAVK，etal．isinducedbyethyleneandsalicylicacid，anditsproductisphosphorylatedbythePtokinase[J]．ThePlantCell，2000，12(5)：771–786．[15]NAKANOT，SUZUKIK，F(xiàn)UJIMURAT，etal.Genome-wideanalysisofthegenefamilyinandrice[J]．PlantPhysiology，2006，140(2)：411–432．[16]ZHANGCH，SHANGGUANLF，MARJ，etal.Genome-wideanalysisoftheAP2/ERFsuperfamilyinpeach()[J]．GeneticsandMolecularResearch，2012，11(4)：4789–4809．[17]GIRARDICL，ROMBALDICV，DALCEROJ，etal.Genome-wideanalysisofthesuperfamilyinappleandtranscriptionalevidenceofERFinvolvementinscabpathogenesis[J]．ScientiaHorticulturae，2013，151：112–121．[18]XIEXL，SHENSL，YINXR，etal．Isolation，classificationandtranscriptionprofilesoftheAP2/ERFtranscriptionfactorsuperfamilyincitrus[J]．MolecularBiologyReports，2014，41(7)：4261–4271．[19]易萍，黃方，李麗，等．芒果乙烯響應轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及表達分析[J]．熱帶作物學報，2022，43(9)：1751–1758．[20]雷明，李志英，王加賓，等．蜻蜓鳳梨基因的克隆與表達特性[J]．西北農(nóng)業(yè)學報，2016，25(12)：1851–1860．[21]PARVEENS，ALTAFF，F(xiàn)AROOQS，etal．Isprolinethequintessentialsentinelofplants?Acasestudyofpostharvestflowersenesc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