重金屬免疫學快速檢測技術研究進展

摘要：重金屬免疫學檢測技術是一種新型檢測技術， 與傳統(tǒng)檢測方法相比具有靈敏、 快速、攜帶方便、費用低的優(yōu)點，可用于現(xiàn)場快速檢測。概述近年來免疫學檢測技術的最新研究進展，并對該類方法的發(fā)展趨勢和在食品安全檢測中的應用前景進行了展望。關鍵詞：重金屬；免疫檢測；酶聯(lián)免疫吸附反應；膠體金免疫層析技術AdvancesinrapidImmunoassayofheavymetalionsLIUYanmei1ZHONGHui1XIANGJunjian*(GuangdongProvinceKeyLaboratoryofMolecularImmunologyandAntibodyEngineering,AntibodyEngineeringcenterofJinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632)Abstract:Heavymetalimmunoassaysarenewmethodsfordetectionofheavymetalions.Comparedtothetraditionalchemicalmethods,immunoassaysarenotonlyfast,cheap,simple,butalsoreasonablyportable,highlysensitiveandselective.Itcouldbeusedforrapiddetectionsite.Therecentprogressofimmunoassaywasintroducedbriefly.Andthetendencyofdevelopmentinimmunoassayanditsprospectusedinthefoodsafetydeterminationwerealsoforwardpromoted.Keywords:Heavymetal;immunoassays;ELISA;CGEIA隨著全社會對食物安全和環(huán)境保護問題的關注不斷提高， 重金屬污染已成為全球性的問題。 環(huán)境污染方面所指的重金屬主要指生物毒性顯著的汞、鎘、鉛、 鉻以及類金屬砷， 還包括具有毒性的重金屬銅、鈷、鎳、錫、釩等污染物。這類有毒物質(zhì)通過經(jīng)由食物鏈濃縮且在身體不斷累積，主要以慢性中毒和遠期效應顯出毒性， 存在巨大的潛在危害。 據(jù)國家環(huán)保局不完全統(tǒng)計， 全國每年因重金屬污染的糧食達 1.2×106萬kg，造成的直接經(jīng)濟超過 200億元，受不同程度重金屬污染的耕地約有 2000萬hm2，約占耕地總面積的 1/5[1]。中國水體重金屬污染問題也十分突出，江河湖庫底質(zhì)的污染率高達 80.1%。重金屬一旦污染環(huán)境，很難自然修復，且隨食物鏈畜積和傳遞，對食品安全與群眾的健康造成嚴重威脅 [2]。因此，近年來重金屬污染越來越受到到人們的重視， 針對重金屬常用的傳統(tǒng)檢測方法包括電感耦合等離子體質(zhì)譜法 (ICP-MS)、石墨爐原子吸收光譜法 (GF-ASS)、火焰原子吸收法 (FASS)以及紫外分光光度法 (UV)等。這些方法測定速度快、干擾少、靈敏度高而且準確性高，是現(xiàn)行的國家重金屬安全檢測的主要檢測方法。 傳統(tǒng)的檢測方法準確可信度高， 但往往需要大型設備儀器， 需要專業(yè)人員操作，有一定的時間地點局限性， 不適合用于快速、 現(xiàn)場定量檢測。 在突發(fā)性環(huán)境污染事件檢測和大范圍取樣實時監(jiān)測時， 需要建立一種靈敏、 高效、快速、方便的檢測方法。 因此，基于單克隆抗體的制備與應用 [3]的免疫學檢測技術，為實現(xiàn)環(huán)境及食品樣品中重金屬的快速定量或半定量檢測提供了一個有效途徑。 本文綜合論述了近幾年來重金屬檢測中的樣品前處理及免疫學檢測技術，并對今后的研究發(fā)展方向做出展望。樣品前處理在實際樣品中， 重金屬一般以化合物形式存在， 不能直接進行檢測， 在檢測前進行樣品前處理除去干擾因素使重金屬以離子態(tài)存在與液相檢測環(huán)境中， 完整地保留被測組分同時使待測組份得到有效濃縮， 檢測前選擇合適的前處理方法非常重要。 目前重金屬殘留檢測中常用的樣品前處理方法：濕式消解法、干灰化法、微波消解法、酸浸提法等。濕式消解法濕消化法是通過強酸在高溫條件下破壞有機質(zhì)使金屬離子釋放出來， 該方法對大多數(shù)樣品適用且回收率高， 但需要耗費大量強酸并有大量有害氣體釋放對環(huán)境和人體損傷較大。 常用的酸是硝酸、高氯酸等混酸消化。干灰化法將樣品在高溫下灼燒， 使樣品中含有的大量纖維素、 蛋白質(zhì)和油脂等有機物質(zhì)分解揮發(fā)， 僅留下礦物質(zhì)灰分。本方法操作簡單、污染小，但消化周期長、灰化溫度比較高、部分元素因為蒸發(fā)而損失掉、坩堝等材料的吸附作用導致回收率低。微波消解法微波消解利用微波的穿透性和激活反應能力， 在密封裝置， 使樣品溫度迅速升高， 加入了一定量的酸溶液，達到使樣品中有機物質(zhì)分解的目的。 Ghaedi等[4]通過微波消解法提取重金屬后， 采用經(jīng)表面活性劑修飾的活性碳來對重金屬進行富集來降低其分析方法的檢測限。 AmorimFilho等[5]采用硝酸、雙氧水混合微波消解式樣后進行石墨爐原子吸收光譜測定抗生素中的 Cd2+和Pb2+含量。浸提法通常為酸提取法即采用鹽酸或硝酸直接浸提所需組份，其直接進樣技術具有操作簡便、速度快、不污染環(huán)境、避免被測元素的揮發(fā)損失等優(yōu)點。李支微等 [6]采用稀HCl、HNO3及H2SO4對樣品進行浸提，探索蔬菜中重金屬 Cu2+、Pb2+、Cd2+的最適浸提條件。 WeiGao等[7]采用1MNH4Ac浸提土壤中的 Cd2+并進行了免疫學分析測定。重金屬特異性抗體的制備自Reardan等[8]第一次通過組建 In3+-L-benzyl-EDTA-BSA復合物抗原重并制備出了 In3+的特異性抗體以來， 國內(nèi)外研究人員通過重金屬與螯合劑配位形成復合半抗原， 再與載體蛋白耦聯(lián)制備完全抗原， 進行動物免疫制備出大量的高特異性單克隆抗體 [9-12]，為免疫學檢測技術的發(fā)展提供了基礎。重金屬離子的免疫學檢測方法近年來，國內(nèi)外諸多學者對重金屬殘留的快速檢測技術進行了許多研究， 產(chǎn)生了許多快速檢測方法，其中主要有酶聯(lián)免疫吸附反應、膠體金試紙法 [13]、生物化學傳感器方法 [14-16]、熒光分析法等，免疫學檢測方法具有一些傳統(tǒng)方法不具備的優(yōu)點，如方便、簡單、快速、易攜而經(jīng)濟的特點，表明該方法可滿足隨時隨地、大范圍、多樣品抽檢安全檢測需要。酶聯(lián)免疫吸附反應( ELISA)酶聯(lián)免疫吸附反應是將抗原抗體特異性免疫反應與酶催化作用相聯(lián)結(jié)起來的一種檢測技術， 具有特異性強、靈敏度高、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等優(yōu)點，一般不需貴重的儀器，對使用人員的專業(yè)技術水平要求不高， 容易普及和推廣。 ELISA檢測重金屬的常用方法是間接競爭 ELISA和直接競爭 ELISA。間接競爭 ELISA其原理是將待檢重金屬離子與螯合劑形成重金屬 -螯合劑復合物后與包被在固相載體上抗原競爭結(jié)合單克隆抗體相同表位， 添加酶標二抗， 經(jīng)底物顯色后， 根據(jù)標準曲線判定樣品中待檢物的含量。WeiGao等[7]用乙二酸四乙胺 (EDTA)螯合重金屬 Cd2+并偶聯(lián)卵清蛋白 (OVA)做免疫原免疫Balb/c小鼠，獲得特異性單克隆細胞株 4F3B6D9A1。其所得腹水型抗體純化后用于間接競爭ELISA(icELISA)其半抑制率和抑制區(qū)間分別為 2.59ng/mL和0.20-40ng/mL，除與Mn2+有2.9%和Hg2+有1.6%交叉外， 以其他金屬離子交叉反應性均小于 1%。在實際樣品檢測中其結(jié)果與石墨爐原子吸收光譜( GFAAS)測定值其平均相關系為 0.9873。YuzhenWang等[17]人以高特異性 Hg2+單克隆抗體為基礎建立 icELISA方法檢測水樣、 牛奶、青菜中的重金屬 Hg2+含量，該 icELISA檢測范圍是 0.1-100ng/mL，其IC50和最低檢測限分別達到了 1.12ng/mL和0.08ng/mL。在實際樣品檢測時回收率為 80.00%-113%，其檢測結(jié)果具有很高的可信度。直接競爭酶聯(lián)免疫吸附反應即為一步競爭免疫檢測原理為樣品中的重金屬離子與螯合劑螯合后與定量的重金屬離子 -螯合劑-酶復合物混合后競爭結(jié)合已包被在固相載體上的抗體，底物顯色后可與標準曲線對比得出重金屬離子濃度。 Blake等人[18]用辣根過氧化物酶( HRP)標記Cd2+-EDTA復合物采用直接競爭免疫檢測法對環(huán)境水樣中的 Cd2+進行檢測，其檢測限可達 0.3ug/ml，其他雜質(zhì)離子 Ca2+、Mg2+、Fe3+對檢測結(jié)果無干擾。檢測結(jié)果與原子吸收法的檢測結(jié)果相吻合，添加標準品回收率達100.29±3.60%。之后Darwis[19]等采用直接競爭免疫檢測法對人血清中 Cd2+含量進行檢測。將抗Cd2+-EDTA復合物的抗體直接包被在底板上， 將從血樣中分離的 Cd2+與適量EDTA混合形成絡合物與競爭物競爭結(jié)合固定于底板上的抗體表位， 通過底物顯色后分析重金屬鎘含量。其檢測濃度范圍達 0.24～100ug/L，與人血中其它金屬無交叉，與原子吸收檢測的結(jié)果相關系數(shù)達0.984。BlakeRobertC[20-22]率領的研究小組采用對各類重金屬離子敏感的單克隆抗體技術對重金屬離子進行現(xiàn)場快速檢測，發(fā)表了系列研究論文并開始將基因重組技術應用于重金屬 -螯合劑復合物單克隆抗體制備，在采用免疫學方法檢測重金屬離子領域處于領先水平。膠體金免疫層析技術膠體金快速免疫層析法 (CGEIA)其原理是將特異性抗體固定于硝酸纖維素膜某一區(qū)域 ,滴加樣品在干燥的硝酸纖維素膜的一段，由于毛細作用， 樣品沿膜向前移動， 當移動至固定有抗體區(qū)域時樣品中的抗原與抗體特異性結(jié)合免疫膠體金可使該區(qū)域顯色，用來進行免疫診斷。它可以快速定性或者半定量檢測重金屬離子[23],其操作簡單、快速、特異性高，之前由于只能用于定性實驗而阻礙了膠體金技術的發(fā)展，如今有相關文獻報道膠體金免疫層析技術可用于定量重金屬檢測。 KaoruAbe等人[24]發(fā)明的顏色掃描儀利用在 Cd2+-EDTA絡合物和抗 Cd2+-EDTA抗體特異性反應形成的抗原抗體復合物濃度來檢測 Cd2+濃度其檢測限≤ 0.01mg/L。由于抗原 -抗體復合物的反應是定量的， 采用一系列濃度梯度的標準 Cd2+-EDTA與抗Cd2+-EDTA抗體反應后通過使用一個顏色掃描儀器以確定顯色程度，以此為標準進行了實際大米樣品和土壤樣品中鎘含量膠體金免疫層析檢測。免疫熒光層析快速診斷技術在膠體金快速免疫層析技術基礎上發(fā)展形成的免疫熒光層析快速診斷技術是以熒光物質(zhì)作為示蹤標志物，應用于抗原抗體反應的一種型免疫標記技術。近年來該技術在醫(yī)學、動植物檢疫、 食蹤標志物，應用于抗原抗體反應的一種型免疫標記技術。近年來該技術在醫(yī)學、品安全監(jiān)督等領域得到了日益廣泛的應用。 付強強等人 [23]建立了一種檢測信號強度與檢測物濃度呈正相關的新型新型熒光淬滅免疫層析試紙條，并成功制備了可用于檢測小分子重金屬 Cr3+的熒光淬滅免疫層析試紙條， 為免疫學方法檢測重金屬和免疫層析試紙條的發(fā)展提供了一個新的方向。免疫熒光偏振技術熒光物質(zhì)標記抗原抗體而進行相應的抗體或抗原測定或定位技術稱為免疫熒光技術。 熒光偏振理論是由Perrin于1926年首先提出，溶液中的熒光分子在受到偏振光激發(fā)時，如果在激發(fā)時分子保持靜止，該分子將發(fā)出固定偏振平面的發(fā)射光(發(fā)射光仍保持偏振性)， 如果分子旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)那么發(fā)射光的偏振平面將不同于初始激發(fā)光的偏振平面?；谠撛?[26],由異硫氰酸熒光素(FITC)標記的taxol與抗taxol的單克隆抗體結(jié)合會使熒光偏振增強。固定抗原( FITC-taxol)和抗體(taxol-antibody)的情況下 ,加入待測的樣品 (含未標記的 taxol)，與標記的 taxol競爭，會導致熒光偏振下降。并由 P/P0可以給出 taxol的標準曲線來確定待測樣品 taxol含量[27]。熒光分析法常用的能發(fā)射熒光的物質(zhì)有有機熒光染料、 量子點、 稀土納米材料等。 當常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光照射后其價電子從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)而激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定價電子會很快衰變至基態(tài)并伴隨著光子的輻射發(fā)出比入射光波長長的出射光被稱之為熒光而一旦停止入射光照發(fā)光現(xiàn)象隨之消失。熒光分析法基于重金屬離子能對熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光猝滅或熒光增強作用濃度越大產(chǎn)生的猝滅或增強作用越大。這一原理對重金屬離子原理進行檢測。 HuiLin等[29]利用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移基于CdSe和CdTe量子點對前列腺抗原( PSA)，在最佳條件下 PSA抗原的線性范圍為2.8-10uL/1，相關性系數(shù) R=0.9992檢測限為 1.5×10-2ug/ml 。與傳統(tǒng)的分光光度法、 原子吸收光譜法等相比熒光分析法靈敏度高檢出限更低選擇性強而且測定樣品不需經(jīng)過分離富集顯色測定等步驟操作簡單，但熒光物質(zhì)只對幾種特定的重金屬離子有響應如Hg2+、Cu2+、Ag＋、測定等步驟操作簡單，但熒光物質(zhì)只對幾種特定的重金屬離子有響應如Pb2+和Co2+離子對其他離子卻不能進行檢測。而且包括金屬在內(nèi)的許多物質(zhì)本身不產(chǎn)生熒光要加入熒光物質(zhì)才能達到熒光分析的目的，這些問題在一定程度上限制了熒光分析的發(fā)展。3.4.1量子點標記免疫檢測技術該技術以半導體納米晶標記抗原或抗體通過量子點顏色改變測定靶標物質(zhì)含量的新型標記檢測技術。以量子點作為標記物，具有熒光穩(wěn)定、激發(fā)光譜廣、發(fā)射光譜窄等優(yōu)點，使的以量子點作為標記物被廣泛應用于免疫診斷與分析中。 陳清愛等人 [28]在量子點對金屬離子有熒光效應特性的基礎上，利用 Cu2+對CdTe量子點熒光淬滅，建立 Cu2+比色傳感器可快速實現(xiàn)對 Cu2+的檢測。同樣利用 Ag+對CdTe量子點熒光淬滅特性，研發(fā)了一種熒光 Ag+定量檢測方法，熒光強度與Ag+濃度在2.0×10-51~0×10-6m