第1節(jié)重組DNA技術的基本工具

解讀章首圖文培養(yǎng)學習志向·勇?lián)鐣熑伪菊抡乱砸赞D基因抗蟲棉產生的背景為情境引入。一方面轉基因抗蟲棉在我國商業(yè)化種植的歷史已有20多年，產生了巨大的社會效益和經濟效益，以它為素材創(chuàng)設情境可以激發(fā)我們的學習興趣；另一方面我國是世界上第二個獨立成功培育擁有自主知識產權的轉基因抗蟲棉的國家，選取這一實例有利于增強我們的民族自豪感和自信心。以此情境為依托，提出問題“為什么傳統(tǒng)的雜交育種方法培育不出抗蟲棉，基因工程卻可以呢？基因工程是如何進行操作的？它給我們的生產和生活帶來了怎樣的影響？”直接指向本章將要學習的重要內容：基因工程的基本原理、操作程序和應用。與情境相匹配，章題圖選用了轉基因抗蟲棉棉鈴和棉桃部分的特寫照片，給人以強烈的視覺沖擊和美的享受。章首頁設計的綠色背景映襯著綠色的棉鈴和枝條，寓意著基因工程煥發(fā)勃勃生機。與前兩章一樣，在章首頁的下方是對基因工程概念的闡述。理清本章架構初識概念體系·具備系統(tǒng)思維第1節(jié)重組DNA技術的基本工具學有目標——課標要求必明記在平時——核心語句必背1．闡述重組DNA技術所需的三種基本工具的作用。2．認同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術創(chuàng)新。3．進行DNA的粗提取與鑒定。1．DNA重組技術的基本工具有限制性內切核酸酶、DNA連接酶和使目的基因進入受體細胞的載體。2．限制性內切核酸酶可識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定位點上切割。3．E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端。4．質粒作為基因工程的載體需具備的條件：能在宿主細胞內穩(wěn)定保存并自我復制；具有一個或多個限制酶切割位點；具有標記基因。[主干知識梳理]一、基因工程及其誕生與發(fā)展1．基因工程的概念2．基因工程的誕生和發(fā)展(1)基因工程的誕生①1944年，艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了_________________，還證明了

。②1953年，沃森和克里克建立了_________________模型并提出了___________________的假說。③1961年，尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的

。④20世紀70年代初，多種

酶、

酶和

酶被相繼發(fā)現(xiàn)，為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。⑤1973年，科學家證明

可以作為基因工程的載體，構建

，導入受體細胞，使外源基因在原核細胞中成功表達，并實現(xiàn)物種間的基因交流。遺傳物質是DNADNA可以在同種生物的不同個體之間轉移DNA雙螺旋結構遺傳物質自我復制密碼子限制DNA連接逆轉錄質粒重組DNA(2)基因工程的發(fā)展①1982年，第一個基因工程藥物——

被批準上市。②1984年，我國科學家朱作言領導的團隊培育出

。③1985年，穆里斯等人發(fā)明

，為獲取目的基因提供了有效手段。④1990年，

計劃啟動。2003年，該計劃的測序任務順利完成。⑤21世紀以來，科學家發(fā)明了多種

，可以實現(xiàn)低成本測定大量核酸序列，加速了人們對基因組序列的了解。⑥2013年，華人科學家張鋒及其團隊首次報道利用最新的

技術編輯了哺乳動物基因組。重組人胰島素世界上第一條轉基因魚PCR人類基因組高通量測序技術基因組編輯二、DNA重組技術的基本工具1．限制性內切核酸酶(簡稱限制酶)——“分子手術刀”(1)來源：主要來自

。(2)功能：能夠識別雙鏈DNA分子的特定

，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的

斷開。(3)結果：產生

或

。2．DNA連接酶——“分子縫合針”(1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的

。原核生物核苷酸序列磷酸二酯鍵黏性末端平末端磷酸二酯鍵(2)種類(填表)項目E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源___________________特點只能連接_________既可以連接黏性末端，又可以連接_______大腸桿菌T4噬菌體黏性末端平末端真核細胞細胞核自我復制限制酶切割進行自我復制標記基因三、重組DNA分子的模擬操作(教材第73頁“思考·討論”)1．材料用具：剪刀代表

，透明膠條代表

。2．切割位點(1)分別從兩張紙上的一條DNA鏈上找出___________________序列，并選_______之間作切口進行“切割”。(2)再從另一條鏈上

之間尋找EcoRⅠ相應的切口剪開。(3)將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來。3．操作結果：若操作正確，兩條鏈的黏性末端應能

；否則，說明操作有誤。EcoRⅠDNA連接酶G—A—A—T—T—CG—A互補的堿基互補配對四、DNA的粗提取與鑒定1．實驗原理(1)

不溶于酒精，某些

溶于酒精。(2)DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于

mol/L的NaCl溶液。(3)在一定溫度下，DNA遇

試劑會呈現(xiàn)藍色。DNA蛋白質2二苯胺2．實驗步驟[邊角知識發(fā)掘]1．(教材第71頁圖3-3變式訓練)已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ識別的堿基序列和酶切位點分別為

和

，分析回答下列問題：(1)在圖中畫出兩種限制酶切割DNA后產生的末端。(2)寫出產生的末端種類：①產生的是

；②產生的是

。(3)限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ識別的

不同，切割位點

(填“相同”或“不同”)，說明限制酶具有

。(4)要將限制酶SmaⅠ切割后產生的末端連接起來，需要

。黏性末端平末端堿基序列不同專一性T4

DNA連接酶2．(教材第72頁圖3-4拓展訓練)根據(jù)大腸桿菌及質粒結構模式圖完成下列問題：(1)圖中A、B分別代表的物質是

、

。(2)①、②兩點具有限制酶切點的是

。(3)圖中氨芐青霉素抗性基因可作為

。擬核DNA質粒①標記基因[教材問題提示]一、旁欄思考題1．(教材第71頁)原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。2．(教材第72頁)DNA連接酶和DNA聚合酶不是一回事。基因工程中所用的連接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E.coli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到的，稱為T4連接酶。這兩種連接酶催化反應基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯鍵(在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基因的羥基之間形成)，那么，二者的差別主要表現(xiàn)如下：(1)DNA聚合酶只能催化單個核苷酸加到已有的核酸片段3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是催化單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。(2)DNA聚合酶以一條DNA鏈為模板鏈，催化形成與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶催化具有互補黏性末端或平末端的DNA片段連接起來，它不需要模板。此外，兩者雖然都是蛋白質，但它們的組成和性質各不相同。二、思考·討論(教材第73頁)1．剪刀代表EcoRⅠ；透明膠條代表DNA連接酶。2．根據(jù)學生實際操作的情況進行指導。如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3．插入的DNA片段不能稱得上一個基因，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。2．限制酶和DNA連接酶的作用是否都體現(xiàn)了酶的專一性？提示：限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，體現(xiàn)了酶的專一性。E.coliDNA連接酶能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，對末端的堿基序列沒有要求；T4DNA連接酶既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端，都對末端的堿基序列沒有要求，因此DNA連接酶的作用沒有體現(xiàn)酶的專一性。[師說重難]

一、基因工程的工具酶1．限制性內切核酸酶(1)作用特點：具有專一性。表現(xiàn)在以下兩個方面：①能夠識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。②能夠切割特定序列中的特定位點。(2)識別序列的特點特點遵循堿基互補配對原則，無論是奇數(shù)個堿基還是偶數(shù)個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的。如右圖實例如

以中心線為軸，兩側堿基反向互補對稱

以為軸，兩側堿基反向互補對稱(3)作用產物：黏性末端或平末端。黏性末端特點是限制性內切核酸酶在它識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時形成的圖示平末端特點是限制性內切核酸酶在它識別序列的中心軸線處切開時形成的圖示2．限制性內切核酸酶與DNA連接酶的關系(1)區(qū)別(2)關系圖解名稱作用應用限制性內切核酸酶使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂用于提取目的基因和切割載體DNA連接酶在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵用于目的基因和載體的連接二、DNA連接酶與DNA聚合酶的比較比較項目DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質相同，都是催化磷酸二酯鍵的形成不同點是否需要模板不需要需要接DNA鏈雙鏈單鏈作用過程在兩個DNA片段間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸加到已存在的DNA單鏈片段上，形成磷酸二酯鍵作用結果將已存在的DNA片段連接合成新的DNA分子用途基因工程DNA復制[在應用中悟][典例1]限制酶a和b的識別序列和切割位點如圖所示，下列有關說法正確的是 (

)A．一個DNA分子中，酶a與酶b的識別序列可能有多個B．酶a與酶b切出的黏性末端不能相互連接C．酶a與酶b切斷的化學鍵不完全相同D．用酶a切割有3個識別位點的質粒，得到4種切割產物[解析]

一個DNA分子中，可能存在一個至多個酶a與酶b的識別序列，A正確；由圖可知，酶a與酶b識別的序列雖然不同，但切出的黏性末端相同，相同的黏性末端能相互連接，B錯誤；酶a與酶b切斷的化學鍵均為相鄰脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，C錯誤；質粒為小型環(huán)狀DNA分子，用酶a切割有3個識別位點的質粒，可得到3種切割產物，D錯誤。[答案]

A[典例2]下列有關DNA連接酶的敘述，正確的是 (

)A．T4DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來B．E.coliDNA連接酶能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接C．DNA連接酶能恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵D．DNA連接酶可連接DNA雙鏈的氫鍵，使雙鏈延伸[解析]

DNA連接酶能使兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，從而將它們連接起來，C正確，D錯誤。E.coliDNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接，B錯誤。T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，A錯誤。[答案]

C[在訓練中評]1．下列有關基因工程的敘述，正確的是

(

)A．限制酶只在獲取目的基因時才用B．重組質粒的形成是在細胞內完成的C．在所有的質粒上總能找到一個或多個限制酶切割位點D．DNA連接酶和DNA聚合酶都連接磷酸二酯鍵解析：限制酶的作用是識別特定核苷酸序列，并在特定的位點切割DNA片段，包括切割目的基因和載體，A錯誤；重組質粒是在細胞外用DNA連接酶形成的，B錯誤；并不是所有的質粒都能作為載體，所以也不是在所有的質粒上總能找到一個或多個限制酶切割位點，C錯誤；DNA連接酶和DNA聚合酶都能使兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，D正確。答案：D

2．如圖為DNA分子的某一片段，其中①②③分別表示某種酶的作用部位，則相應的酶依次是 (

)A．DNA連接酶、限制酶、解旋酶B．限制酶、解旋酶、DNA連接酶C．解旋酶、限制酶、DNA連接酶D．限制酶、DNA連接酶、解旋酶解析：由圖示分析可知，①處為氫鍵，是解旋酶的作用部位；②處為磷酸二酯鍵，是限制酶的作用部位；③處為兩個DNA片段的缺口，是DNA連接酶的作用部位。答案：C

2．基因工程用作載體的質粒常有特殊的標記基因，請舉例說明其作用。提示：標記基因如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，其作用是便于重組DNA分子的篩選。3．DNA粗提取與鑒定實驗中，選用不同的實驗材料采取的方法可能有所不同，這是為什么？本實驗提取的DNA可能含有哪些雜質？提示：一般植物材料需要充分研磨，但有些動物組織只需要制成勻漿(如豬肝等)，然后加蒸餾水使其吸水漲破，即可釋放出細胞內的DNA；若以雞血細胞為實驗材料直接加蒸餾水即可。所以不同的實驗材料可能采用的方法不同。可能含有核蛋白、多糖等雜質。說明：一般來說，天然載體不能同時滿足所有條件，要對其進行人工改造才可以使用。3．基因工程載體的作用(1)用它作為運輸工具，將目的基因送入受體細胞中。(2)利用它在受體細胞內對目的基因進行大量復制并表達。二、DNA的粗提取與鑒定實驗的注意事項1．因為玻璃棒有吸附DNA的作用，濃縮后的DNA絲狀物可以用緩緩旋轉玻璃棒的方法卷起。如果DNA絲狀物較少，不易吸附在玻璃棒上，也可以用筷子等表面粗糙的用具來幫助DNA分子纏繞。2．粗提取的DNA絲狀物要用濾紙吸去上面的水分或離心得到的沉淀物要晾干，然后再溶解在2mol/L的NaCl溶液中進行鑒定。3．DNA的溶解度與NaCl溶液濃度有關。實驗中鑒定DNA通常用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA，需要不斷攪拌以增加DNA的溶解量，通常要3min以上。4．加入預冷酒精后，要用玻璃棒緩慢、輕輕的沿一個方向攪拌溶液，玻璃棒不能插入到燒杯底部。5．二苯胺試劑一般要現(xiàn)用現(xiàn)配，以保證實驗效果。6．鑒定DNA的其他方法。①紫外燈照射法：用蒸餾水配制質量分數(shù)為0.05%的溴化乙錠(EB)溶液，將玻璃棒上纏繞的白色絲狀物抹到蠟紙上，再滴1滴EB溶液染色。將蠟紙放在紫外燈(260nm)下照射(暗室中)，可呈現(xiàn)橙紅色的熒光(DNA的紫外吸收高峰在260nm處)。②電泳法：此方法適合鑒定純度較高的DNA。[在應用中悟][典例1]作為基因的運輸工具——載體，必須具備的條件之一及理由是 (

)A．能夠在宿主細胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因B．具有多個限制酶切點，以便于目的基因的表達C．具有某些標記基因，以使目的基因能夠與其結合D．對宿主細胞無傷害，以便于重組DNA的篩選[解析]作為載體必須能夠在宿主細胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因，A正確；作為載體必須具有一個或多個限制酶切點，以便于目的基因的插入，B錯誤；作為載體必須具有標記基因，以便于重組DNA分子的篩選，C錯誤；作為載體必須是安全的，對受體細胞無害，以便宿主細胞能進行正常的生命活動，D錯誤。[答案]

A[典例2]下列有關“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是 (

)A．向洋蔥組織中加入蒸餾水并攪拌可釋放核DNAB．實驗中的過濾是為了得到紗布上的DNAC．向DNA濾液中加入冷酒精緩慢攪拌，可見玻璃棒上有白色絲狀物D．可以選用不同的實驗材料但提取DNA的方法是相同的[解析]洋蔥細胞為植物細胞，有細胞壁保護，因此加蒸餾水不會釋放核DNA，A錯誤；過濾洋蔥研磨液，目的是為了獲得含有核物質的濾液；B錯誤；DNA不溶于酒精，因此向DNA濾液中加入冷酒精緩慢攪拌，可見玻璃棒上有白色絲狀物，C正確；選擇的實驗材料不同，提取DNA的方法會有所不同，D錯誤。[答案]

C[在訓練中評]1．下列關于質粒的敘述，正確的是 (

)A．質粒是廣泛存在于細菌細胞中的一種顆粒狀細胞器B．質粒是細菌細胞質中能夠自主復制的小型環(huán)狀DNA分子C．細菌質粒和真核細胞DNA的基本結構單位不同D．細菌質粒的復制過程一定是在細胞外獨立進行的解析：質粒廣泛存在于細菌細胞中，是細菌細胞質中能夠自主復制的小型環(huán)狀DNA分子，不是細胞器，A錯誤，B正確；細菌質粒是環(huán)狀DNA分子，和真核細胞DNA的基本結構單位相同，均為脫氧核苷酸，C錯誤；有的質?？梢哉系剿拗骷毎娜旧wDNA上，伴隨宿主細胞一起復制，D錯誤。答案：B

2．(2021·山東高考)粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是

(

)A．加入適量的木瓜蛋白酶B．37～40℃的水浴箱中保溫10～15分鐘C．加入與濾液體積相等的、體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精D．加入NaCl調節(jié)濃度至2mol/L→過濾→調節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L解析：木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白質類雜質，由于酶具有專一性，不能水解DNA，過濾后在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物，A正確；37～40℃的水浴箱中保溫10～15分鐘不能去除濾液中的雜質，應該放在60～75℃的水浴箱中保溫10～15分鐘，使蛋白質變性析出，B錯誤；向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后在得到的濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精，此時DNA析出，不會