西普蘭對(duì)慢性應(yīng)激大鼠血糖及免疫功能的影響

西普蘭對(duì)慢性應(yīng)激大鼠血糖及免疫功能的影響

慢性休克是身體受到多種刺激后產(chǎn)生的一系列廣泛而復(fù)雜的副作用，包括神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)政部系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。國內(nèi)外研究結(jié)果表明,慢性應(yīng)激可影響神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的功能,導(dǎo)致機(jī)體形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能狀態(tài)的改變,而某些藥物對(duì)其具有一定的保護(hù)作用。西酞普蘭是選擇性較強(qiáng)的5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI),對(duì)抑郁障礙有較好的治療效果。然而西酞普蘭對(duì)血糖及免疫系統(tǒng)的影響如何,目前尚缺乏這方面的研究。我們?cè)噲D在建立慢性應(yīng)激大鼠模型的同時(shí),預(yù)防性使用西酞普蘭,觀察大鼠血糖、免疫指標(biāo)的變化,以探討慢性應(yīng)激及西酞普蘭對(duì)大鼠血糖、免疫系統(tǒng)的影響,為慢性應(yīng)激引起的神經(jīng)精神疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。材料和方法一、材料表面1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心雄性SD大鼠32只,體重(240±20)g,浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,紹興文理學(xué)院生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地動(dòng)物室飼養(yǎng)。大鼠按分組分箱飼養(yǎng),每組8只,進(jìn)食飲水自由,適應(yīng)1周后,進(jìn)入實(shí)驗(yàn)程序。2.-4-氟苯基-1,3-二氫-5-異苯并呋喃腈氫溴酸鹽的合成氫溴酸西酞普蘭(喜普妙),化學(xué)名為1-[3-(二甲胺基)丙基]-1-(4-氟苯基)-1,3-二氫-5-異苯并呋喃腈氫溴酸鹽,與乙酰膽堿、組胺、去甲腎上腺素、多巴胺、γ-氨基丁酸及阿片受體結(jié)合作用輕微。3.試劑免疫組化試劑盒,均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。二、方法1.應(yīng)激組和普蘭片灌胃的處理飼養(yǎng)環(huán)境光/暗周期為各12h,光照時(shí)間為7:00～19:00,室溫(22±2)℃。對(duì)照組不做任何處理,應(yīng)激組以等體積生理鹽水灌胃,實(shí)驗(yàn)1、2組分別以4和8mg·kg-1·d-1氫溴酸西酞普蘭片灌胃(蒸溜水溶解)。并將應(yīng)激組、實(shí)驗(yàn)組大鼠每天置于80cm×40cm×40cm,水深25cm、水溫(20±2)℃的玻璃缸中強(qiáng)迫游泳15min,共4周,形成慢性應(yīng)激模型。2.血液測(cè)試實(shí)驗(yàn)第1天、第10天、第20天、第29天,各組大鼠尾靜脈采血,用美國強(qiáng)生血糖儀測(cè)量血糖(mmol/L)。3.腎上腺素尾腺、脾指數(shù)實(shí)驗(yàn)第29天,動(dòng)物斷頭放血處死后,取出腎上腺、胸腺、脾臟組織稱重,計(jì)算腎上腺(胸腺、脾臟)指數(shù)=腎上腺(胸腺、脾臟)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。4.石蠟包埋片組光鏡標(biāo)本將胸腺置于4%中性多聚甲醛溶液中固定48h以上,常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片,片厚4μm。電鏡標(biāo)本置于2.5%戊二醛溶液中固定備用。5.免疫組織化學(xué)染色和細(xì)胞壞死檢測(cè)按試劑盒說明書操作。6.電鏡觀察固定標(biāo)本→梯度脫水→包埋→切片→載網(wǎng)→染色(檸檬酸鉛、醋酸鈾)→電鏡觀察。陽性凋亡細(xì)胞判別標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞核皺縮,體積變小,核膜變形呈不規(guī)則形、呈鋸齒狀或邊界不清或核膜消失。三、均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示;組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、實(shí)驗(yàn)組血糖測(cè)定與應(yīng)激組比較,對(duì)照組血糖在實(shí)驗(yàn)第1天、第10天,無明顯變化(P>0.05),第20天、第29天降低(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組血糖在實(shí)驗(yàn)第1天、第10天、第20天,無明顯變化(P>0.05),第29天降低(P<0.05);與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組血糖除在實(shí)驗(yàn)第20天增高(P<0.05),其余時(shí)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。二、各組大鼠臟器指數(shù)比較與應(yīng)激組比較,對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組大鼠腎上腺指數(shù)下降,胸腺、脾臟指數(shù)上升(P<0.05);與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)1組大鼠腎上腺、胸腺、脾臟指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),實(shí)驗(yàn)2組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)下降(P<0.01);與實(shí)驗(yàn)1組比較,實(shí)驗(yàn)2組胸腺、脾臟指數(shù)下降(P<0.05)(表2)。與應(yīng)激組比較,aP<0.05bP<0.01與對(duì)照組比較,cP<0.01與實(shí)驗(yàn)1組比較,dP<0.05eP<0.01三、bx-q-ms評(píng)分對(duì)照組胸腺細(xì)胞排列緊密、核圓,皮、髓質(zhì)均可見大片Bcl-2蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞,特別是髓質(zhì),細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)呈深黃色或黃色,髓質(zhì)偶見Bax蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞(見封三圖1,2),并可見較多染色陽性細(xì)胞,細(xì)胞核濃縮,呈橢圓形、不規(guī)則形,顏色為棕色或黃色(見封三圖3)。與對(duì)照組比較,應(yīng)激組胸腺細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞減少,髓質(zhì)可見大片Bax蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞(見封三圖4,5),髓質(zhì)可見大量TUNEL染色陽性細(xì)胞(見封三圖6)。實(shí)驗(yàn)1組可見大片Bcl-2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞,染色增強(qiáng)、呈棕色,Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞減少,染色減弱(見封三圖7,8),TUNEL染色陽性細(xì)胞減少,染色減弱(見封三圖9)。實(shí)驗(yàn)2組胸腺細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞減少、Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多(見封三圖10,11),并可見大量TUNEL染色陽性細(xì)胞,核濃縮現(xiàn)象明顯(見封三圖12)。四、應(yīng)激組細(xì)胞的形態(tài)對(duì)照組大鼠胸腺細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常(見封三圖13);應(yīng)激組可見較多細(xì)胞的細(xì)胞核皺縮,體積變小,核膜變形呈不規(guī)則形、呈鋸齒狀或邊界不清或核膜消失(見封三圖14);實(shí)驗(yàn)1組較應(yīng)激組凋亡細(xì)胞減少。應(yīng)激對(duì)大鼠尾腺細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)作為制造抑郁應(yīng)激模型的經(jīng)典方法,在應(yīng)激相關(guān)研究及抗抑郁藥療效評(píng)定中得到廣泛應(yīng)用,我們的前期研究也證實(shí)了強(qiáng)迫游泳制造慢性應(yīng)激模型的有效性。本研究結(jié)果顯示,應(yīng)激組大鼠腎上腺指數(shù)值變大、血糖呈升高趨勢(shì),并在20天后顯著高于對(duì)照組,表明慢性應(yīng)激對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響,其機(jī)制可能是通過激活大腦-下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的作用,導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素分泌增加,使血糖升高,這與Herman等研究結(jié)果一致。另外,本研究實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖除第20天高于對(duì)照組外,其余均與對(duì)照組相近,提示西酞普蘭的干預(yù)作用,要在用藥一段時(shí)間后才能起效,其作用機(jī)制可能是通過抑制大腦-下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的作用,導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素分泌減少。胸腺、脾臟是主管機(jī)體免疫功能的重要器官。本研究結(jié)果顯示,應(yīng)激組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)低于對(duì)照組,提示慢性應(yīng)激可致大鼠胸腺、脾臟的萎縮,這與施桂蘭、楊寧波等研究結(jié)果一致,其調(diào)控機(jī)制可能與下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸功能有關(guān),認(rèn)為5-羥色胺(5-HT)能抑制應(yīng)激的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)使用西酞普蘭的實(shí)驗(yàn)1組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)接近對(duì)照組,提示適當(dāng)劑量(4mg·kg-1·d-1)的西酞普蘭對(duì)大鼠胸腺、脾臟具有保護(hù)作用,這可能與西酞普蘭對(duì)5-HT再攝取抑制作用相關(guān)。而實(shí)驗(yàn)2組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)低于對(duì)照組、接近應(yīng)激組,可能是藥物劑量(8mg·kg-1·d-1)過大對(duì)胸腺、脾臟的損害,提示在使用西酞普蘭時(shí),注意藥物劑量的控制。Yang等認(rèn)為細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的敏感性取決于胞內(nèi)Bcl-2/Bax競爭性的二聚體化過程。Bax同二聚體形成便可誘導(dǎo)凋亡;隨Bcl-2蛋白表達(dá)量的上升,越來越多的Bax二聚體分開,與Bcl-2形成比Bax-Bax更穩(wěn)定的Bax-Bcl二聚體,拮抗Bax-Bax誘導(dǎo)凋亡的作用,則細(xì)胞不發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果表明,應(yīng)激組大鼠胸腺細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)減少減弱,而有更多更強(qiáng)的Bax表達(dá),同時(shí)TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞增多,電鏡觀察凋亡細(xì)胞增多,提示慢性應(yīng)激對(duì)大鼠胸腺細(xì)胞的損害;而實(shí)驗(yàn)1組大鼠在使用西酞普蘭后,與對(duì)照組比較胸腺細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)增多增強(qiáng),Bax表達(dá)減少減弱,同時(shí)TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞減少,電鏡觀察凋亡細(xì)胞減少,提示西酞普蘭對(duì)胸腺細(xì)胞的保護(hù)作用,同時(shí)也證實(shí)