芋主要病毒種類的鑒定與脫毒技術(shù)研究

芋主要病毒種類的鑒定與脫毒技術(shù)研究

芋頭（又名芋頭和芋頭）屬于天南星科，屬天南星科，共13種，中國(guó)8種?，F(xiàn)基本分為多子芋、大魁芋和多頭芋3類。原產(chǎn)中國(guó)、印度、馬來半島等熱帶、亞熱帶沼澤地帶。作為糧蔬兩用小經(jīng)濟(jì)作物,在我國(guó)已有多年的栽培歷史,因富含的淀粉顆粒小,質(zhì)地滑軟,營(yíng)養(yǎng)豐富,而受到日本、韓國(guó)、香港等世界各國(guó)和地區(qū)人們的歡迎,因此山東種植的芋主要用于以上國(guó)家的出口創(chuàng)匯。通常利用無性繁殖的作物,經(jīng)過多年留種種植,病毒通過種塊在植物體內(nèi)逐代積累,受到的病毒侵染不斷積累,引起品種退化是不可避免的,有的甚至嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量。目前種植區(qū)的芋檢測(cè)到的病毒主要有蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus,TuMV),黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV),煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)。市場(chǎng)上通過脫毒、消除病毒病的經(jīng)濟(jì)作物已有的成功經(jīng)驗(yàn),馬鈴薯、甘薯脫毒苗都已進(jìn)入大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)階段,并取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。而對(duì)芋的組織培養(yǎng),僅僅局限于擴(kuò)大繁殖系數(shù),脫毒苗的生產(chǎn)一直沒有達(dá)到產(chǎn)業(yè)化程度,我們利用梯度熱處理和莖尖脫毒技術(shù)對(duì)芋進(jìn)行了脫毒組織培養(yǎng),利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行病毒檢測(cè),獲得了脫毒苗,為下一步產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的科研基礎(chǔ)。1材料和方法1.1脫毒1.1.1頂芽的殺菌處理挑選保存完好,無腐爛斑點(diǎn)的芋,整齊地排列在花盆中,用沙子覆蓋到整個(gè)芋塊的2/3處,放置到生物中心全自動(dòng)溫室中,待其萌發(fā)。在芽生長(zhǎng)到1～3cm時(shí)切取頂芽,去掉周圍表皮,底部芋塊,流動(dòng)水沖洗1h左右,分別用兩種消毒劑3個(gè)時(shí)間段處理殺菌,每種處理分別接種30個(gè)頂芽,剝除外層葉鞘,接種到培養(yǎng)基①(MS)中,觀察殺菌效果。用0.1%的HgCl2分別浸泡2、4、6min,設(shè)為處理1、2、3,安替富民10%原液分別浸泡8、10、12min,設(shè)為處理4、5、6。試劑:HgCl20.1%,安替富民10%原液(天津安達(dá)有限公司生產(chǎn))1.1.2莖尖的處理(1)莖尖直接脫毒:莖尖按處理5的方法消毒殺菌后,按葉鞘剝離一層、兩層、全部剝離的程度分為三級(jí)(此時(shí)頂芽最多保留兩個(gè)葉原基),設(shè)為處理5-1、處理5-2、處理5-3;解剖鏡下切取莖尖為處理5-4。以上每個(gè)處理得到的莖尖接種20個(gè)到培養(yǎng)基①中,觀察成活率。(2)恒溫脫毒:脫毒材料放入光照培養(yǎng)箱中,直接將溫度調(diào)到37℃,保持一定的空氣濕度,一個(gè)月后發(fā)現(xiàn)芋頂芽發(fā)黃、萎蔫,切取莖尖時(shí)易把莖尖損傷,接種后成活率低,效果不好。(3)梯度升溫脫毒:脫毒材料放入光照培養(yǎng)箱中溫度調(diào)至25℃,每隔3天調(diào)高2℃,直至溫度達(dá)到37℃,觀察芋頭生長(zhǎng)情況。兩周后發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)良好,又將溫度升至40℃,頂芽生長(zhǎng)一直很飽滿、正常。1.2培養(yǎng)基成分測(cè)定芋(同上)沙培,放置溫室,催芽。待芽長(zhǎng)至2～3cm時(shí)切取莖尖,按照殺菌消毒效果較好的處理5-2殺菌取芽,接種到培養(yǎng)基1-13中,得到的組培苗標(biāo)為5-2-1;梯度熱處理后,按處理5-2得到的脫毒苗標(biāo)記為5-2-2;觀察生長(zhǎng)分化情況并記錄結(jié)果。培養(yǎng)基主要成分為MS,單位mg/L,pH5.8,瓊脂粉用量7.5g/L。1、MS2、MS+BA1.0+NAA0.23、MS+BA2.0+NAA0.24、MS+BA4.0+NAA0.25、1/2MS+BA0.1+IAA0.36、MS+KT1.0+IAA0.27、MS+BA2.0+IAA0.58、1/2MS+BA0.5+IAA0.2+GA0.39、1/2MS+BA0.5+IAA0.2+GA0.1510、MS+BA1.511、MS+KT2.0+IBA0.112、1/2MS+KT1.0+BA0.2+NAA0.0513、1/2MS2結(jié)果和分析2.1脫毒效果與分析2.1.1材料表面殺菌效果不理想表面消毒處理結(jié)果見表1,由表1數(shù)據(jù)可以看出。處理5的成活率最高,對(duì)材料的損傷較弱,是其成活率較高的原因。在實(shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn),材料表面殺菌效果不理想,接種到培養(yǎng)基中,經(jīng)常出現(xiàn)細(xì)菌污染。因此我們把處理5的莖尖材料切的稍大一些,殺菌10min后,清洗2～3次,剝?nèi)ヒ粚尤~鞘,切除部分塊莖,再消毒處理2min重復(fù)一次,接種后污染率明顯下降,在培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)良好,通過多次剝?nèi)~鞘,切除塊莖,多次沖洗,減少了污染幾率。2.1.2組培苗的選擇,對(duì)于種子環(huán)境質(zhì)量高,分離莖尖脫毒按處理統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。結(jié)果表明處理5-1、5-2的效果較好,處理5-2的成活率高達(dá)85%;在后來的培養(yǎng)過程中,發(fā)現(xiàn)處理5-2不但成活率高,而且分化效果好于處理5-1;按處理5-2的方法直接切取莖尖,接種到培養(yǎng)基中,分化得到的材料為組培苗5-2-1;經(jīng)過梯度熱處理后,按處理5-2的方法切取莖尖,得到的材料為組培苗5-2-2;增殖快繁以后進(jìn)行病毒檢測(cè)。2.2培養(yǎng)基的選擇按照培養(yǎng)基的成分配比,分批取芽接種,經(jīng)過半年多的時(shí)間篩選出適合的分化培養(yǎng)基,連續(xù)轉(zhuǎn)接3次,進(jìn)一步確定接種到此培養(yǎng)基中芽的分化數(shù)量和生長(zhǎng)質(zhì)量,篩選結(jié)果見表3。以上培養(yǎng)基中,只有不含激素的1、3培養(yǎng)基中的頂芽沒有分化;7、10培養(yǎng)基中分化效果較好,從實(shí)際操作和經(jīng)濟(jì)角度看,最終選擇培養(yǎng)基10作分化培養(yǎng)基。進(jìn)行分化增殖培養(yǎng),成活率和分化效果都比較理想。分化量達(dá)到一定數(shù)量后,發(fā)現(xiàn)芋頭分生苗生根系分化良好。在幾種培養(yǎng)基中,只要分開單株培養(yǎng),都能生長(zhǎng)出發(fā)達(dá)的根系。3脫毒和熱處理脫毒總之,組織培養(yǎng)技術(shù)已成為現(xiàn)代生物工程的基礎(chǔ),也是生物工程在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用較廣的一個(gè)方面。植物脫毒既是農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求,也是科技水平提高的表現(xiàn),目前脫除病毒的主要經(jīng)濟(jì)作物有地瓜(花葉病毒、皺葉病毒、羽狀斑駁病毒),蘋果(花葉病毒、綠皺縮葉病毒、莖溝病毒、莖痘病毒、銹果病毒等24種病毒),生姜(煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒),大蒜(大蒜花葉條紋病毒、退化病毒、花葉病毒、潛隱病毒),馬鈴薯(X病毒、Y病毒、M病毒、卷葉病毒等),都已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段,取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。莖尖脫毒和熱處理脫毒技術(shù)已在以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主的植物中得到廣泛應(yīng)用,我們對(duì)芋采用梯度熱處理和莖尖相結(jié)合的脫毒技術(shù),脫毒效果好,梯度熱處理后的芋頭頂芽飽滿,莖尖生長(zhǎng)旺盛,鱗片脆薄,易于剝離,切取的莖尖可以達(dá)到2.5mm,大大提高了莖尖接種的成活率,利于以后的增殖快繁。脫毒苗送到山東農(nóng)業(yè)大學(xué)和浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)一步利用以ELISA法為主,同時(shí)結(jié)合反轉(zhuǎn)錄PCR,生物學(xué)法、電鏡技術(shù)等輔助手段,進(jìn)一步確定脫毒效果。病毒檢測(cè)結(jié)果證明脫毒效果好,方法簡(jiǎn)單有效,脫毒率高。國(guó)外對(duì)芋的研究主要是芋葉的保存、