基因組學(xué)講課

染色質(zhì)和DNA修飾韓蘭春2013年11月28日主要內(nèi)容1、染色質(zhì)，DNA的概念2、組蛋白修飾種類及對基因表達(dá)的影響3、DNA修飾種類及對表達(dá)的影響4、染色質(zhì)重構(gòu)回顧知識染色質(zhì)（chromatin）最早是1879年Flemming提出的用以描述核中染色后強(qiáng)烈著色的物質(zhì)。現(xiàn)在認(rèn)為染色質(zhì)是細(xì)胞間期細(xì)胞核內(nèi)能被堿性染料染色的物質(zhì)。染色質(zhì)的基本化學(xué)成分為脫氧核糖核酸核蛋白，它是由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成的復(fù)合物。根據(jù)著色的深淺染色質(zhì)有常染色質(zhì)和異染色質(zhì)之分DNA：即脫氧核糖核酸，是一種長鏈聚合物，組成單位稱為四種脫氧核苷酸，也叫堿基。DNA是染色體的主要化學(xué)成分。DNA是一種分子，可組成遺傳指令，以引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機(jī)能運(yùn)作。帶有遺傳信息的DNA片段稱為基因。常染色質(zhì)與異染色質(zhì)1.常染色質(zhì)：基因表達(dá)活躍的區(qū)域，染色體結(jié)構(gòu)較為疏松2.異染色質(zhì)：基因表達(dá)沉默的區(qū)域，染色體結(jié)構(gòu)致密核小體常染色質(zhì)異染色質(zhì)常規(guī)的染色質(zhì)修飾染色質(zhì)化學(xué)修飾的類型染色質(zhì)化學(xué)修飾是指對染色質(zhì)的組成成分，如DNA、RNA、組蛋白、非組蛋白進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)的添加或去除的反應(yīng)過程。常見的染色質(zhì)化學(xué)修飾方式有：甲基化-去甲基化，乙?；?去乙酰，磷酸化去磷酸。除此之外，還包括泛素化ADP-核糖基化和二硫鍵形成等修飾方式。染色質(zhì)中的組蛋白和DNA成分是最主要的化學(xué)修飾底物。目前，已在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一系列的染色質(zhì)修飾酶類，這些酶不僅具有高度的位點(diǎn)特異性，而且對底物原有的修飾狀態(tài)也有選擇性。組蛋白的化學(xué)修飾位點(diǎn)通常位于其N-端或C-端尾區(qū)，極少數(shù)情況下（如H3-K79）位于內(nèi)部；有些位點(diǎn)可發(fā)生雙修飾反應(yīng)；相鄰位點(diǎn)的磷酸化修飾與甲基化修飾可能相互干擾染色質(zhì)中的組蛋白和DNA成分是最主要的化學(xué)修飾底物。

一組蛋白的化學(xué)修飾組蛋白化學(xué)修飾發(fā)生在組蛋白N端尾部，尤其是組蛋白H3和H4的修飾起始了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。組蛋白尾部由20個(gè)氨基酸組成，并且從DNA轉(zhuǎn)彎處的核小體間延伸出來。acK:acetyl-Lys;meR:methyl-Arg.meK:methyl-Lys;PS:phospho-Ser.uK:ubiquitinatedLys組蛋白的修飾1、甲基化組蛋白甲基化是由組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(histonemethyltransferase，HMT)完成的。甲基化可發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上，而且賴氨酸殘基能夠發(fā)生單、雙、三甲基化，而精氨酸殘基能夠單、雙甲基化，這些不同程度的甲基化極大地增加了組蛋白修飾和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的復(fù)雜性。甲基化的作用位點(diǎn)在賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)的側(cè)鏈N原子上。*Lys甲基化常發(fā)生在：組蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位。*Arg甲基化常發(fā)生在:組蛋白H3的第2、l7、26位及H4的第3位。

組蛋白甲基化對基因表達(dá)的影響研究表明：組蛋白精氨酸甲基化是一種相對動態(tài)的標(biāo)記，精氨酸甲基化與基因激活相關(guān)，而H3和H4精氨酸的甲基化丟失與基因沉默相關(guān)。相反，賴氨酸甲基化似乎是基因表達(dá)調(diào)控中一種較為穩(wěn)定的標(biāo)記。例如，(1)與基因激活相關(guān)的賴氨酸殘基甲基化：H3第4位、第36位、第79位。(2)與基因沉默相關(guān)的賴氨酸殘基甲基化：H3第9位、第27位以及H4的第20位。

但應(yīng)當(dāng)注意的是，甲基化個(gè)數(shù)與基因沉默和激活的程度相關(guān)。2．乙酰化

組蛋白乙酰化主要發(fā)生在H3、H4的N端比較保守的賴氨酸位置上，是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；竻f(xié)調(diào)進(jìn)行。組蛋白乙?；识鄻有裕诵◇w上有多個(gè)位點(diǎn)可提供乙?；稽c(diǎn)，但特定基因部位的組蛋白乙?；腿ヒ阴；且砸环N非隨機(jī)的、位置特異的方式進(jìn)行。

·組蛋白乙?；贒NA復(fù)制過程中短暫發(fā)生.·

組蛋白乙酰化與激活基因表達(dá)相關(guān).組蛋白的乙?；趦煞N環(huán)境下發(fā)生組蛋白乙酰化乙?；赡芡ㄟ^中和賴氨酸以及精氨酸的正電荷來增加與DNA的排斥力，以及通過相互作用蛋白的影響，來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。早期對染色質(zhì)及其特征性組分進(jìn)行歸類劃分時(shí)就有人總結(jié)指出：異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域組蛋白呈低乙酰化，常染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域組蛋白呈高乙酰化。最近有研究發(fā)現(xiàn)，某些HAT復(fù)合物含有一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，某些HDAC復(fù)合物含有已被證實(shí)的阻遏蛋白。這些發(fā)現(xiàn)支持了高乙?；c激活基因表達(dá)、低乙?；c抑制基因表達(dá)有關(guān)的看法。組蛋白乙?；鰪?qiáng)基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制1）乙酰化轉(zhuǎn)錄因子，使之與DNA結(jié)合能力增強(qiáng)；2）轉(zhuǎn)錄因子活化的結(jié)構(gòu)域招募HATs復(fù)合物；3）HAT復(fù)合物的乙酰化組蛋白，打開染色質(zhì)；4）轉(zhuǎn)錄激活；5）HATs復(fù)合物中共激活因子被乙酰化修飾；6）HATs復(fù)合物乙酰化之后離開，轉(zhuǎn)錄激活消失。H3和H4組蛋白的乙?；c活性的染色質(zhì)相聯(lián)系,而其甲基化則與失活的染色質(zhì)相關(guān).組蛋白修飾是一個(gè)關(guān)鍵事件3．組蛋白的其他修飾方式相對而言，組蛋白的甲基化修飾方式是最穩(wěn)定的，所以最適合作為穩(wěn)定的表觀遺傳信息。而乙?；揎椌哂休^高的動態(tài)，另外還有其他不穩(wěn)定的修飾方式，如磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等等。這些修飾更為靈活的影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，通過多種修飾方式的組合發(fā)揮其調(diào)控功能。所以有人稱這些能被專識別的修飾信息為組蛋白密碼。這些組蛋白密碼組合變化非常多，因此組蛋白共價(jià)修飾可能是更為精細(xì)的基因表達(dá)方式。另外，研究發(fā)現(xiàn)H2B的泛素化可以影響H3K4和H3K79的甲基化，這也提示了各種修飾間也存在著相互的關(guān)系。

組蛋白共價(jià)修飾的功能基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)、DNA復(fù)制、染色體凝聚等

4組蛋白修飾與基因調(diào)控基因表達(dá)是一個(gè)受多因素調(diào)控的復(fù)雜過程.組蛋白是染色體基本結(jié)構(gòu)-核小體中的重要組成部分,其N-末端氨基酸殘基可發(fā)生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚ADP糖基化等多種共價(jià)修飾作用.

大多數(shù)組蛋白上的修飾位點(diǎn)被單一的,特異的修飾,但一些位點(diǎn)可以多于一個(gè)位點(diǎn)的修飾.個(gè)別功能與一些位點(diǎn)的修飾直接相關(guān).

組蛋白修飾為什么會影響基因表達(dá)呢？

兩種解釋(1)

組蛋白的修飾可通過影響組蛋白與DNA雙鏈的親和性,從而改變?nèi)旧|(zhì)的疏松或凝集狀態(tài),(2)或通過影響其它轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因啟動子的親和性來發(fā)揮基因調(diào)控作用.組蛋白修飾對基因表達(dá)的調(diào)控有類似DNA遺傳密碼的調(diào)控作用.二DNA修飾（一）DNA甲基化

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，這一修飾途徑可能存在于所有高等生物中并與基因表達(dá)密切相關(guān)。大量研究表明，DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。DNA甲基化能引起染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性以及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。研究證實(shí)，CpG二核苷酸的胞嘧啶的甲基化導(dǎo)致了人體三分之一以上剪輯轉(zhuǎn)換而引起的遺傳病。實(shí)驗(yàn)證明，甲基化這個(gè)過程不但與DNA的復(fù)制起始及錯(cuò)誤修正時(shí)的定位有關(guān)，還可以通過基因的表達(dá)參與細(xì)胞生長，發(fā)育過程及染色印跡，X染色體失活等的調(diào)控。

（1）

DNA甲基化的定義

DNA甲基化是指:在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG島的CpG二核苷酸的胞嘧啶5‘碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。（2）甲基化轉(zhuǎn)移酶

維持性甲基化轉(zhuǎn)移酶和從頭合成型甲基化轉(zhuǎn)移酶；——維持性甲基化轉(zhuǎn)移酶是遺傳DNA甲基化狀態(tài)最重要的酶類，它可以在甲基化母鏈模板的指導(dǎo)下甲基化新合成鏈的相應(yīng)位點(diǎn)，使DNA迅速由半甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆谆癄顟B(tài)，即參與甲基化的維持；——從頭合成型甲基化轉(zhuǎn)移酶可以催化為甲基化的CpG成為mCpG，此過程不需母鏈指導(dǎo)，但速度很慢。但這一類甲基化酶是特異基因受甲基化調(diào)控的主要因子，在基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控中起十分重要的作用。DNA甲基化的位點(diǎn)DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7－甲基鳥嘌呤（7-mG）C5-mCCpG島（CpGIsland）CpG島（CpGIsland）：成簇的CpG二聯(lián)體被稱為“CpG島”CpG島的結(jié)構(gòu)特征：一般以1－2kb的DNA長度范圍內(nèi)，（G＋C）含量超過60％（正常的為20％），并有高濃度的CpG二核苷酸，高出平均水平10～20倍。CG島通常是一些稀有的內(nèi)切酶的切點(diǎn)，如果基因組中這種限制位點(diǎn)的緊密成簇，則表明含有CG島，然后進(jìn)行Southern印跡可鑒定基因。人基因組內(nèi)有45000個(gè)CpG島，其中16000個(gè)在Alu序列中，還存在29000個(gè)CpG島;組成型表達(dá)的基因中100％含有CpG，在組織特異性表達(dá)的基因中40％有CpG。沒有甲基化的C極易變成U而被修復(fù)，甲基化C脫氨基后形成T，因此CpG序列容易丟失。在兩個(gè)CpG島之間有8－10堿基的重復(fù)序列，該序列決定了甲基化發(fā)生的地點(diǎn)。CpG占基因組的10％，其中70－80％為甲基化。未甲基化的CpG島處于組成性表達(dá)基因啟動子的周圍；也存在于一些組織特異性基因的啟動子周圍CpG島的甲基化改變了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，造成高度螺旋化，失去了DNase敏感性，阻止了啟動子的活化，同時(shí)能夠與甲基化CpG結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合，如組蛋白去乙?；傅龋梢砸种苹虻谋磉_(dá)。DNA甲基化的分布染色體水平上，DNA甲基化在著絲粒附近水平最高基因水平上，DNA甲基化高水平區(qū)域涵蓋了多數(shù)轉(zhuǎn)座子，假基因和小RNA編碼區(qū),在最新的研究發(fā)現(xiàn)，甲基化似乎對長度較短的基因有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力，而對長基因的調(diào)控能力十分微弱。甲基化與基因表達(dá)調(diào)控關(guān)系圖

甲基化與基因表達(dá)調(diào)控

*

哺乳動物基因組的大片區(qū)域被甲基化的DNA序列所標(biāo)記，這種甲基化的DNA區(qū)通常是異染色質(zhì)區(qū)；*甲基化的DNA序列經(jīng)?？梢员灰恍〥NA結(jié)合蛋白(如MeCP2)所識別，這些DNA結(jié)合蛋白可以招募組蛋白去乙?；负徒M蛋白甲基化酶，從而修飾附近的染色質(zhì)；*因此,

DNA甲基化往往能標(biāo)記異染色質(zhì)形成的區(qū)域。甲基化的作用：1、原核生物中，DNA甲基化是為了抵抗噬菌體侵害而發(fā)生堿基C和A上的化學(xué)修飾。如大腸桿菌的限制修飾系統(tǒng)中，自身DNA特定位點(diǎn)的甲基化可以避免限制性內(nèi)切酶的切割。2、真核生物中，甲基化被分為對稱性甲基化(canotical/symmetricmethylation)，包括CpG和CpNpG，以及非對稱甲基化(asymmetricmethylation)，包括CpHpH。多數(shù)細(xì)胞5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在CpG中。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、組蛋白修飾及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化為正常發(fā)育所必需。正常細(xì)胞中DNA甲基化的功能包括轉(zhuǎn)座因子的沉默、病毒序列的失活、染色體完整性的維持、X染色體失活、基因組印記及大量基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。一些研究還發(fā)現(xiàn)隨著個(gè)體年齡的不同，DNA甲基化水平存在差異，提示個(gè)體的發(fā)育和衰老過程與DNA甲基化相關(guān)DNA甲基化特點(diǎn)：可遺傳的，即這類改變通過有絲分裂或減數(shù)分裂能在細(xì)胞或個(gè)體世代間遺傳；（表觀遺傳學(xué)）是基因表達(dá)的改變;沒有DNA序列的變化，或不能用DNA序列變化來解釋。在DNA去甲基化酶的作用下可以去甲基化，即具有可逆性。（二）、基因突變定義：是由于DNA分子中發(fā)生堿基對的增添、缺失或替換，而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變。從分子水平上看，基因突變是指基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變?；螂m然十分穩(wěn)定，能在細(xì)胞分裂時(shí)精確地復(fù)制自己，但這種穩(wěn)定性是相對的。在一定的條件下基因也可以從原來的存在形式突然改變成另一種新的存在形式，就是在一個(gè)位點(diǎn)上，突然出現(xiàn)了一個(gè)新基因，代替了原有基因，這個(gè)基因叫做突變基因。于是后代的表現(xiàn)中也就突然地出現(xiàn)祖先從未有的新性狀。基因突變的性質(zhì)（1）普遍性（2）隨機(jī)性（3）稀有性（4）可逆性

（5）少利多害性（6）不定向性（7）有益性（8）獨(dú)立性（9）重演性

基因突變的種類（1）堿基置換突變：轉(zhuǎn)換和顛換（2）移碼突變（3）缺失突變（4）插入突變基因突變在我們實(shí)際生活當(dāng)中也有一定的應(yīng)用，比如誘變育種，害蟲防治等。（三）另外兩種新堿基

DNA堿基組成是各種生物一個(gè)穩(wěn)定的特征，這種組成不受年(菌)齡以及突變因素以外的外界條件的影響，即使個(gè)別基因突變，堿基組成也不會發(fā)生明顯變化。一般認(rèn)為DNA分子含有四種堿基：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。近幾年，有人將表觀遺傳學(xué)修飾——5-甲基胞嘧啶稱為第5種堿基，5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）稱為第6種堿基。

研究人員在人體胚胎干細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)老鼠器官染色體組中發(fā)現(xiàn)了兩種新型的DNA堿基：5fC（5-甲酰胞嘧啶）和5caC（5-羧基胞嘧啶），改變了原有認(rèn)為DNA堿基只有4種（近期增加至6種）的觀點(diǎn)，這對于干細(xì)胞和癌癥的研究具有重要意義。這兩種堿基實(shí)際上都是由胞嘧啶經(jīng)由張毅教授研究組一直研究的關(guān)鍵蛋白：Tet蛋白修飾后形成。這一研究成果公布在Science雜志上。

張毅教授，這位華人科學(xué)家曾入選2008年ScienceWatch選出的高影響力論文的數(shù)量最多的研究人員，他是分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域高影響力論文的數(shù)量最多前十位頂級科學(xué)家之一，發(fā)表了多篇Nature，Science，Cell等頂級雜志文章，是一位高產(chǎn)高效的科學(xué)家。

Tet蛋白是重新編程已經(jīng)分化的細(xì)胞的一種重要功能蛋白，人類和小鼠都擁有Tet蛋白，研究發(fā)現(xiàn)這種蛋白在DNA