海桑屬紅樹植物的基因多態(tài)性分析課件

紅樹植物基因多態(tài)性分析海洋藥學(xué)教研室紅樹植物基因多態(tài)性分析海洋藥學(xué)教研室了解不同分子標(biāo)記原理和方法，掌握RAPD技術(shù)原理和整體流程；了解基因組DNA提取原理，掌握植物基因組DNA提取原理和方法；熟悉PCR技術(shù)原理，了解PCR技術(shù)的改進(jìn)應(yīng)用；掌握核酸電泳技術(shù)和原理；熟悉相關(guān)生物軟件和儀器的使用；鍛煉整體實驗設(shè)計的思路，了解研究過程中的結(jié)果分析手段。實驗?zāi)康牧私獠煌肿訕?biāo)記原理和方法，掌握RAPD技術(shù)原理和整體流程；不同種類、不同的生態(tài)環(huán)境下生長的植物體內(nèi)的化學(xué)成分不同的現(xiàn)象：如藥材的道地性貝母：川貝和浙貝桔生淮南為桔，移于淮北為枳

化學(xué)多態(tài)性chemicalpolymorphism不同種類、不同的生態(tài)環(huán)境下生長的植物體內(nèi)的化學(xué)成分不同的現(xiàn)象生物種群中存在的與等位基因相關(guān)的若干種表現(xiàn)型。ABO血型膚色等多態(tài)性生物種群中存在的與等位基因相關(guān)的若干種表現(xiàn)型。多態(tài)性在一個生物群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦稱遺傳多態(tài)性或基因多態(tài)性?；蚨鄳B(tài)性一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域。對于一個體而言，基因多態(tài)性堿基順序終生不變，并按孟德爾定律世代相傳。

基因多態(tài)性GeneticPolymorphism在一個生物群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基DNA位點多態(tài)性sitepolymorphism長度多態(tài)性lengthpolymorphism基因多態(tài)性的表現(xiàn)DNA位點多態(tài)性sitepolymorphism基因宏觀角度種屬差異環(huán)境因素基因結(jié)構(gòu)與功能角度復(fù)等位基因（multipleallele）同一基因座出現(xiàn)的多個基因，形成系列稱為復(fù)等位基因為數(shù)眾多的復(fù)等位基因，是某些復(fù)合體（HLA）高度多態(tài)性的最主要原因共顯性（condominance）一對等位基因同為顯性，稱為共顯性共顯性大大增加了種群中某些基因表型的多樣化基因多態(tài)性的形成宏觀角度基因多態(tài)性的形成形態(tài)學(xué)標(biāo)記Morphologicalmarker外部形態(tài)特征，如植物的矮稈、紫鞘、卷葉等細(xì)胞標(biāo)記Cytologicalmarker染色體的核型(染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)、隨體有無、著絲粒位置等)帶型(C帶、N帶、G帶等)分子標(biāo)記molecularmarker蛋白分子標(biāo)記利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性來反映不同品種的差異，如同工酶、等位酶等DNA分子標(biāo)記通過對品種DNA的多態(tài)性即DNA堿基序列的差異進(jìn)行分析，從而鑒別不同品種。遺傳標(biāo)記Geneticmarker形態(tài)學(xué)標(biāo)記Morphologicalmarker遺傳標(biāo)極大的豐富性；多態(tài)性高，變異類型豐富；大多數(shù)DNA標(biāo)記是共顯性的，很容易區(qū)分雜合體和純合體；DNA標(biāo)記對性狀的表達(dá)沒有影響；DNA標(biāo)記具有高度穩(wěn)定性，不受環(huán)境條件和個體發(fā)育影響，無組織或器官特異性，準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性較高；DNA分子標(biāo)記的優(yōu)點極大的豐富性；DNA分子標(biāo)記的優(yōu)點限制性片段長度多態(tài)性RestrictionFragmentLengthPolymorphism（RFLP）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNARandomAmplifiedPolymorphicDNA（RAPD）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性AmplicationFragmentLengthPolymorphismAnalysis（AFLP）微衛(wèi)星技術(shù)MicrosatelliteDNA單核苷酸多態(tài)性Singlenucleotidepolymorphism（SNP）DNA分子標(biāo)記研究方法限制性片段長度多態(tài)性DNA分子標(biāo)記研究方法由于DNA的多態(tài)性，導(dǎo)致DNA分子中限制酶切位點及數(shù)目發(fā)生改變，用限制酶切割基因組時，所產(chǎn)生的片段數(shù)目和每個片段的長度不同，即限制性片段長度多態(tài)性。這種多態(tài)性可通過特定探針雜交進(jìn)行檢測，從而可比較不同品種或個體間DNA水平的差異（即多態(tài)性），通過多個探針的比較則可以確立生物的進(jìn)化和分類關(guān)系。廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及生物進(jìn)化和分類的研究。RFLP由于DNA的多態(tài)性，導(dǎo)致DNA分子中限制酶切位點及數(shù)目發(fā)以一系列不同的隨機(jī)排列的寡聚核酸單鏈為引物，對所研究的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳分析，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性；擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。RAPD技術(shù)現(xiàn)已廣泛用于品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系研究。RAPD以一系列不同的隨機(jī)排列的寡聚核酸單鏈為引物，對所研究的基因組海桑屬紅樹植物的基因多態(tài)性分析課件利用PCR檢測酶切產(chǎn)生的特異片段，結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。AFLP利用PCR檢測酶切產(chǎn)生的特異片段，結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)微衛(wèi)星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡單重復(fù)序列；每個重復(fù)單元的長度在1—10bp之間，不同數(shù)目的核心序列呈串聯(lián)重復(fù)排列（SSR，SimpleSequenceRepeats），而呈現(xiàn)出長度多態(tài)性。每個SSR序列的基本單元重復(fù)次數(shù)在不同基因型間差異很大，從而形成其座位的多態(tài)性。各SSR座位兩側(cè)一般是相對保守的單拷貝序列，據(jù)此可設(shè)計引物，微衛(wèi)星技術(shù)微衛(wèi)星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡單重復(fù)序單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)其中的一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，而空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受到排阻力大小不同。通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以特異性將構(gòu)象上有差異的分子分離開。單核苷酸多態(tài)性（SNP）單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)RAPD技術(shù)原理RAPD技術(shù)原理基因組中存在眾多反向重復(fù)序列，每一隨機(jī)引物進(jìn)行PCR的過程中，單一引物可與反向重復(fù)序列結(jié)合，使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴(kuò)增。而引物結(jié)合位點DNA序列的改變以及擴(kuò)增位點之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導(dǎo)致擴(kuò)增片段數(shù)目和長度的差異，可通過電泳檢測而顯示出DNA片段的多態(tài)性。RAPD技術(shù)繼承了PCR技術(shù)的優(yōu)點，可在所研究的物種沒有任何分子生物學(xué)基礎(chǔ)下，對其進(jìn)行DNA多態(tài)性的分析。所需樣品量少，靈敏度高，效率較高。技術(shù)小結(jié)基因組中存在眾多反向重復(fù)序列，每一隨機(jī)引物進(jìn)行PCR的過程中模板制備（DNA提?。㏄CR擴(kuò)增瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物數(shù)據(jù)分析進(jìn)化樹構(gòu)建RAPD技術(shù)流程模板制備（DNA提取）RAPD技術(shù)流程基本儀器設(shè)備：臺式高速離心機(jī)、移液器、水浴鍋、PCR儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、紫外分光光度計、微波爐等生物材料：不同屬植物試劑和酶：石英砂、緩沖液A、消化液（含1.5%SDS）、KAc、酚/氯仿/異戊醇、異丙醇、RNaseA、隨機(jī)引物、TaqDNA聚合酶、瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA上樣緩沖液等實驗材料基本儀器設(shè)備：臺式高速離心機(jī)、移液器、水浴鍋、PCR儀、電泳保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性純化后不應(yīng)存在對酶有抑制作用的物質(zhì)排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染基因組DNA提取保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性基因組DNA提取SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后乙醇沉淀水相中的DNA。經(jīng)典的SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離稱取植物樹葉0.5g，加入石英砂和1.5ml緩沖液A（臨用前加入50μlβ-巰基乙醇）中快速研磨；葉片磨碎后加入3ml緩沖液A，12000rpm離心5min。去除上清，將沉淀懸浮于0.7ml的1.5%SDS消化液（65℃預(yù)熱，臨用前加入50μlβ-巰基乙醇）中，65℃水浴40min消化，間或混勻；加入1/3體積5MKAc（pH7.0），混勻，冰浴30min，12000rpm離心5min；取上清，加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25：24：1）抽提，12000rpm離心5min；上清轉(zhuǎn)管，加入等體積氯仿抽提，12000rpm離心5min；SDS提取植物基因組提取稱取植物樹葉0.5g，加入石英砂和1.5ml緩沖液A（臨用前上清轉(zhuǎn)管，加入等體積異丙醇輕輕混勻，12000rpm離心5min，沉淀溶解于300μl無菌雙蒸水中，加入2μlRNase（10mg/ml）37℃保溫30min，消化RNA；在總體系中加入300μl無菌雙蒸水，然后加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25：24：1）抽提，12000rpm離心5min；上清轉(zhuǎn)管，加入等體積氯仿抽提，12000rpm離心5min，上清轉(zhuǎn)移至一潔凈1.5mleppendorf管中；加入等體積異丙醇，混勻后，12000rpm離心10min，沉淀用無水乙醇洗滌2次，80％乙醇洗滌一次，沉淀晾干后，加入50μl無菌水溶解，獲得DNA溶液。1.0％瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量。SDS法提取植物基因組上清轉(zhuǎn)管，加入等體積異丙醇輕輕混勻，12000rpm離心5紅樹植物多糖含量較高，可能嚴(yán)重影響后續(xù)試驗。通過用緩沖液A對植物組織進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)先去除大量的多糖，以達(dá)到提取高純度DNA的目的。巰基乙醇的作用：由于植物中含有大量多酚類物質(zhì)，容易與DNA形成不溶性沉淀，造成DNA的損失；此外多酚類物質(zhì)是氧化性物質(zhì)，在溶液中形成氧化環(huán)境，易引起DNase對DNA的降解，在溶液中加入巰基乙醇以形成還原性環(huán)境，避免DNase的作用。酚-氯仿抽提：酚是有效的蛋白質(zhì)變性劑，可以去除蛋白，但核酸提取過程中常采用酚和氯仿的混合液，這是因為：兩種不同有機(jī)溶劑較之單一使用一種效果更佳，而且可以避免酚造成的核酸損失。接下來，在使用酚-氯仿后需用氯仿再次抽提主要是為了防止溶液中痕量酚對于后續(xù)操作中酶的影響。相關(guān)知識：紅樹植物多糖含量較高，可能嚴(yán)重影響后續(xù)試驗。通過用緩沖液A對關(guān)鍵技術(shù)：離心柱結(jié)構(gòu)：特殊硅基質(zhì)吸附材料，可特異性吸附某種成分，透過雜質(zhì)；關(guān)鍵原理：正常情況：核酸表面覆蓋水化層，以維持其水溶性；高鹽濃度下：高鹽離子破壞核酸表面親水薄膜的有序排列，形成疏水環(huán)境，核酸可吸附于硅膜表面；低鹽濃度下：核酸表面水化層恢復(fù)，可被從硅質(zhì)膜上洗脫下來硅膜吸附法原理關(guān)鍵技術(shù)：離心柱結(jié)構(gòu)：特殊硅基質(zhì)吸附材料，可特異性吸附某種成硅膜吸附法流程硅膜吸附法流程植物組織（細(xì)胞）磨碎后經(jīng)裂解液裂解；蛋白質(zhì)、多糖、細(xì)胞殘片被沉淀去除；然后基因組DNA在高鹽狀態(tài)下選擇性吸附于硅膜，再通過一系列漂洗－離心步驟,進(jìn)一步將多糖、多酚和細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅膜上洗脫下來。簡化了繁瑣的有機(jī)試劑抽提步驟，減少了環(huán)境污染和操作損失，操作要求低，重復(fù)性好；徹底去除可能抑制后續(xù)操作的抑制物（如乙醇、有機(jī)溶劑），提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；高效快速，易于自動化；基于細(xì)胞裂解的膜吸附法植物組織（細(xì)胞）磨碎后經(jīng)裂解液裂解；蛋白質(zhì)、多糖、細(xì)胞殘片被RB1(ResuspensionBuffer1)重懸緩沖液重懸并裂解細(xì)胞，變性核蛋白體，釋放核酸RNaseARNA酶A降解RNA，去除RNA干擾PB1(PrecipitationBuffer1)沉淀緩沖液沉淀細(xì)胞碎片、蛋白、多糖等雜質(zhì)BB1(BindingBuffer1)結(jié)合緩沖液（已加入乙醇）作用于核酸表面水化層，通過電荷作用力促進(jìn)核酸結(jié)合于硅膜CB1（CleanBuffer1）清潔緩沖液去除未能結(jié)合于硅膜表面的雜質(zhì)、鹽分等WB1（WashBuffer1）漂洗緩沖液（已加入乙醇）去除以弱離子力結(jié)合的雜質(zhì)、鹽分等，消除高鹽環(huán)境，純化產(chǎn)物ddH2O(無菌雙蒸水)洗脫核酸

制備管（含硅質(zhì)膜）收集洗脫廢液試劑盒組成RB1(ResuspensionBuffer1)重懸取新鮮植物組織100mg在研缽中加入液氮充分碾磨成細(xì)粉；轉(zhuǎn)移細(xì)粉至一個1.5ml離心管，加入250μl緩沖液RB1和15μlRnaseA，旋渦振蕩，充分混勻以助裂解；55℃水浴15分鐘，在水浴過程中顛倒離心管2-3次，混合樣品；12000rpm離心5min，輕輕吸取上清至另一潔凈1.5ml離心管；加入100μl緩沖液PB1，充分混勻，冰浴5分鐘，12000rpm離心5min，小心吸取上清至一新的1.5ml離心管，避免擾動和吸取界面物質(zhì)；加入375μl緩沖液BB1，充分混勻；（加入BB1可能出現(xiàn)絮狀沉淀，但不影響DNA提?。┤∪炕旌弦海ò赡艿某恋恚┘尤胛街?，（吸附柱放入收集管），12000rpm離心30sec，棄去收集管中廢液；吸附柱容量有限，先加650μl溶液離心，棄廢液，再加入剩余的溶液，再次離心植物基因組提取步驟取新鮮植物組織100mg在研缽中加入液氮充分碾磨成細(xì)粉；植在吸附柱中加入500μl清潔液CB1，12,000rpm離心30sec，棄廢液；在吸附柱中加入500μl漂洗液WB1，12,000rpm離心30sec，棄廢液；并重復(fù)本步驟一次；將吸附柱放回空收集管中，12,000rpm離心2分鐘，徹底去除殘留的WB1，以免其中殘留乙醇影響后續(xù)操作；取出吸附柱，放入一潔凈1.5ml離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl雙蒸水（事先在60℃水浴中預(yù)熱），室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘，獲得基因組DNA溶液；取5μlDNA溶液，以1.0%agarose電泳檢測，剩余DNA保存于-20℃中，作為PCR擴(kuò)增模板；植物基因組提取步驟在吸附柱中加入500μl清潔液CB1，12,000rpm基因組DNA質(zhì)量可通過瓊脂糖電泳初步檢測：基因組DNA片段應(yīng)在20kb－30kb之間；高質(zhì)量的基因組DNA帶型單一無拖尾現(xiàn)象。預(yù)期結(jié)果基因組DNA質(zhì)量可通過瓊脂糖電泳初步檢測：預(yù)期結(jié)果移液器的使用選擇合適量程2個檔位保養(yǎng)與維護(hù)離心機(jī)的使用配平時間配合注意事項移液器的使用注意事項基于DNA的半保留復(fù)制原理，通過溫度變化控制模板變性、引物退火和引物延長的多個循環(huán)來擴(kuò)增特異DNA序列的過程，上一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物又作為下一輪擴(kuò)增的模板，使得擴(kuò)增呈指數(shù)增長，因而可作為核酸檢測的一種非常靈敏的技術(shù)。PCR擴(kuò)增原理基于DNA的半保留復(fù)制原理，通過溫度變化控制模板變性、引物退DNA模板含有目的基因的DNA引物一對寡核苷酸鏈，可以與目的基因的上游和下游（5’和3’端）分別配對反應(yīng)緩沖液：提供酶促反應(yīng)緩沖體系Mg2＋

taq酶的輔基，反應(yīng)的輔因子dNTPmixPCR反應(yīng)的原料Taq酶耐熱的DNA聚合酶，催化DNA復(fù)制PCR體系構(gòu)成DNA模板含有目的基因的DNA引物一對寡核苷酸鏈，可以與目的Predenatue90-95℃3-5minDenature（90℃-96℃）雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA30sec-1minAnneal（25℃-65℃）系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈30sec-1mindependsontheduplexExtension（70℃-75℃）在Taq酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈About1min(+30secper500bp)25-30cyclesFinalextension72℃10minPCR步驟Predenatue90-95℃3-5minPCR步驟PCR擴(kuò)增模板稀釋：將提取的各組基因組DNA稀釋20倍，作為模板，并分發(fā)給各組：稀釋至200μl為各組分裝10μl隨機(jī)引物：全班選取16種隨機(jī)引物，每組一種隨機(jī)引物(10μmol/L)2.0μldNTP(2.5mmol/Leach)2.5μl10×PCR緩沖液2.5μlTaqDNA聚合酶（5U/μl）0.5μl鎂離子（25mM）2.5μL模板DNA5.0μl滅菌雙蒸水ddH2O10.0μlPCR體系（25μl）：PCR擴(kuò)增模板稀釋：將提取的各組基因組DNA稀釋20倍，作為RAPD模板和引物組合Primers模板ABCDEFS1123456S2789101112S3131415161718S4192021222324S5252627282930S6313233343536S7373839404142S8434445464748S9495051525354S10555657585960S11616263646566S12676869707172S13737475767778S14798081828384S15858687888990S16919293949596RAPD模板和引物組合Primers模板ABCDEFS1PCR條件預(yù)變性94℃3min變溫循環(huán)30T94℃30sec37℃30sec

30T72℃1.5min再延伸72℃10minPCR條件預(yù)變性94℃3min變溫循環(huán)30T94℃3加樣需在PCR專用的薄壁管中體系內(nèi)同樣的成分（水、buffer、引物、dNTP、taq酶）可預(yù)先配置成預(yù)混液，再分裝至各管；預(yù)混液的配制：按比例放大，并需考慮加樣誤差在各管中加入不同成分（模板DNA），加入反應(yīng)預(yù)混液后，混勻；注意事項加樣需在PCR專用的薄壁管中注意事項瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，來源于海藻；瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固將形成良好的電泳介質(zhì)，糖鏈依氫鍵