基于pdms的微流控細(xì)胞陣列芯片的設(shè)計(jì)與研究

基于pdms的微流控細(xì)胞陣列芯片的設(shè)計(jì)與研究

對大量化合物進(jìn)行了快速、高流量、低試劑消耗和降低成本的研究。近幾年來出現(xiàn)快速、高效的高通量篩選(Highthroughputscreening,HTS)被廣泛發(fā)展和應(yīng)用,成為藥物篩選的主要技術(shù)手段之一,但其自身存在一些局限,如多孔板(通常為96孔板)消耗的試劑量大、樣品的分配和操作難度較大、設(shè)備昂貴等。而基于微加工技術(shù)的微流控芯片技術(shù)具有分析速度快、試劑消耗少、易于集成和高通量分析等諸多優(yōu)點(diǎn),可以克服高通量藥物篩選的限制,為基于細(xì)胞的藥物篩選、組織工程和生物傳感器提供新的研究平臺。利用微流控技術(shù),開發(fā)微流控陣列細(xì)胞芯片應(yīng)用于高通量藥物篩選具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢。微流控芯片這個(gè)微小平臺可以集成256個(gè)或更多的細(xì)胞培養(yǎng)腔微陣列,改變常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞藥物篩選的高通量化,而且芯片微納升級體積大大減少了試劑消耗量,減低藥物篩選成本;微流控芯片設(shè)計(jì)二維或者三維的微結(jié)構(gòu)區(qū)域可產(chǎn)生低剪切力,使多種化合物進(jìn)入、混合,形成濃度梯度,觀察細(xì)胞對不同濃度藥物的反應(yīng),從而進(jìn)行藥物對細(xì)胞的毒性分析;微流控芯片的集成化優(yōu)勢非常明顯,在芯片內(nèi)可以集成微閥、微泵和電極等器件,將藥物的合成分離富集、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)、藥物效果檢測等多個(gè)步驟集成到一塊芯片,實(shí)現(xiàn)藥物篩選的自動(dòng)化分析。將微流控技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建藥物篩選的細(xì)胞微系統(tǒng)平臺是目前的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞在芯片的區(qū)域分布以及如何實(shí)現(xiàn)微流體的操控以及對細(xì)胞進(jìn)行藥物作用是微流控技術(shù)在細(xì)胞高通量藥物篩選的研究應(yīng)用的關(guān)鍵和難點(diǎn)。因此本研究介紹一種用于藥物篩選的微流控細(xì)胞陣列芯片。采用微加工技術(shù)設(shè)計(jì)和制作該芯片,在芯片上制作獨(dú)特的培養(yǎng)腔陣列及其微通道,進(jìn)行細(xì)胞的固定分布和共培養(yǎng),并在芯片上設(shè)計(jì)藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò),當(dāng)藥物注入芯片時(shí),得到不同濃度的藥物成分作用細(xì)胞。微流體的控制通過微閥網(wǎng)絡(luò)來實(shí)現(xiàn),從而保證了培養(yǎng)腔不同細(xì)胞培養(yǎng)的相對獨(dú)立,保持藥物濃度梯度的穩(wěn)定性。同時(shí)本研究進(jìn)行了抗腫瘤藥物伊立替康(CTP-11)對肝癌細(xì)胞的藥物篩選實(shí)驗(yàn),通過實(shí)驗(yàn)室自制的加熱平臺上實(shí)現(xiàn)對該芯片細(xì)胞活性和藥物作用的實(shí)時(shí)觀察和檢測。1實(shí)驗(yàn)部分1.1藥物梯度網(wǎng)絡(luò)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的微流控細(xì)胞陣列芯片如圖1a所示,它有3層結(jié)構(gòu),上面一層是閥控制通道層,中間一層是流體通道層,下面一層是適合細(xì)胞貼壁的玻璃層(圖1b所示)。流體層包括藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)、6×6細(xì)胞培養(yǎng)腔陣列以及進(jìn)出樣管道。細(xì)胞培養(yǎng)腔陣列在縱橫二維是連通的,縱向通道可以同時(shí)進(jìn)樣培養(yǎng)3種不同細(xì)胞,橫向通道可以進(jìn)樣培養(yǎng)液和藥物。流體層的通道高為50μm,寬為100μm,每個(gè)培養(yǎng)腔為600μm×600μm,中間有一個(gè)半徑為200μm的C型壩結(jié)構(gòu),壩高45μm,寬50μm,該結(jié)構(gòu)可以將細(xì)胞攔截在壩內(nèi),保證細(xì)胞在固定的區(qū)域生長,而培養(yǎng)基和藥物等液體可以自由流通;藥物梯度網(wǎng)絡(luò)包含2個(gè)進(jìn)樣孔和5級濃度梯度通道,可產(chǎn)生6個(gè)不同濃度的藥物溶液。閥控制通道層有2組控制閥:橫向閥和縱向閥,通過閥的開關(guān)作用實(shí)現(xiàn)對下一層的細(xì)胞培養(yǎng)陣列橫向通道和縱向通道的液流控制。1.2雙向pdms-1-電子鼻自適應(yīng)該微流控芯片采用多次軟光刻技術(shù)以及模塑法制作,具體工藝流程如圖2所示。芯片制作的關(guān)鍵工藝是通過制作雙層的SU-8負(fù)性光刻膠的流體層模具形成壩結(jié)構(gòu)以及熱鍵合法制作雙層的PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片。首先是利用“多次曝光、一次顯影”工藝制作SU-8膠雙層的芯片模具。在清洗干凈的硅片基底上甩涂稀釋的SU8-2025(MicroChemCorp,MA,USA,用SU8-2025與環(huán)戊酮按體積比100:53稀釋而成),厚約5μm,放在熱板上65oC烘1min,然后升溫至95oC保持2min,緩慢降溫至室溫,在光刻機(jī)上第1次曝光后,將硅片放到熱板上進(jìn)行PEB(Postexposedbake),即65oC加熱烘1min,然后升溫到95oC保持2min,之后緩慢降至室溫,這樣第一層的圖形就轉(zhuǎn)移到SU-8光刻膠上。再將SU8-2050甩涂到基片上,完成前烘,將第二層掩模板與第一層光刻圖形對準(zhǔn),第二次曝光和后烘最后超聲輔助顯影就形成雙層圖形結(jié)構(gòu)的SU-8模具。同理,完成單層的閥控制層SU-8模具的制作。為制作雙層的PDMS芯片,先將PDMS(DowCorning,Michigan,USA)單體與固化劑按重量比20:1均勻混合,抽真空進(jìn)行脫氣處理后,倒入流體層SU-8模具,在甩膠臺上轉(zhuǎn)速800r/min甩涂30s,然后放置在熱板上70oC加熱10min,形成150μm厚的PDMS薄層;接著調(diào)配單體與固化劑比為10:1的PDMS,真空脫氣處理后,澆注在閥控制層的SU-8模具中,厚為5mm,在熱板70oC加熱20min,冷卻后從硅片剝離,將剝離的閥控制PDMS層在顯微鏡下與流體層的PDMS薄層對準(zhǔn)貼合,然后移至熱板上90oC加熱1h,完成雙層PDMS的熱化學(xué)鍵合反應(yīng),最后將雙層PDMS從硅片上剝離,打好孔并切割合適大小,與清洗干凈的玻璃片進(jìn)行氧等離子鍵合,形成芯片通道的封閉,完成微流控雙層PDMS細(xì)胞陣列芯片的制作。1.3不同細(xì)胞感染pdms的影響在芯片集成微閥以實(shí)現(xiàn)對芯片通道微流體的控制。微閥的結(jié)構(gòu)是由上層閥控制層PDMS與下層流體層的PDMS薄膜構(gòu)成。由于PDMS具有透氣性,不適合采用空氣閥,因此本實(shí)驗(yàn)芯片采用液壓閥,即在閥通道內(nèi)注入水或其他液體,通過注射器對閥通道的液體施加壓力(圖3b,P>0),下層的PDMS因楊氏模量小且厚度薄,易發(fā)生形變,阻擋下層的PDMS通道液體的流動(dòng),從而實(shí)現(xiàn)閥對通道的封閉效果;當(dāng)壓力移除后(圖3a,P=0),PDMS薄膜恢復(fù)形變,恢復(fù)流體層通道的液體的流通。芯片的閥控制層有兩組閥:橫向閥和縱向閥。當(dāng)多種細(xì)胞進(jìn)樣時(shí),橫向閥打開,縱向閥關(guān)閉,不同的細(xì)胞分別進(jìn)入縱向的細(xì)胞培養(yǎng)腔,由于縱向閥阻隔了橫向通道的液體流動(dòng),各個(gè)縱向的細(xì)胞不會(huì)進(jìn)入別的縱向細(xì)胞培養(yǎng)腔,從而實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞共培養(yǎng)(圖3c);當(dāng)進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)時(shí),橫向閥關(guān)閉,縱向閥打開,藥物溶液可以保持穩(wěn)定的濃度作用于橫向的不同細(xì)胞的培養(yǎng)腔(圖3d)。因此芯片兩組閥的操控可以進(jìn)行對芯片通道內(nèi)的微流體的控制,實(shí)現(xiàn)了芯片多種細(xì)胞的共培養(yǎng)和不同濃度的藥物分別對不同的細(xì)胞進(jìn)行刺激的功能。1.4細(xì)胞培養(yǎng)和活性微流控細(xì)胞陣列芯片培養(yǎng)的細(xì)胞采用人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人肝正常細(xì)胞HL-7702(上海中科院上海細(xì)胞生物研究所)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-2C(美國ATCC公司)。細(xì)胞培養(yǎng)液為RMPI1640(Gibco),添加10%的胎牛血清(杭州四季青)和1%的鏈青雙抗(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司),細(xì)胞消化液為0.25%的胰酶和0.02%的EDTA(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。用聚合物管將制作好的芯片與帶有開關(guān)閥的注射器接連,接口處用粘接劑ELASTOSILE43(wackerchemie)密封。連接好的芯片通入75%乙醇,用紫外線照射1h,進(jìn)行消毒處理。先用注射泵(PHD2000,HarvardApparatus)在芯片內(nèi)通入細(xì)胞培養(yǎng)液2h,以排除芯片內(nèi)殘余的乙醇和氣泡,有利于細(xì)胞在培養(yǎng)腔內(nèi)貼壁生長。芯片移到實(shí)驗(yàn)室自制的ITO玻璃加熱平臺,用連接開關(guān)閥的注射器對芯片的縱向閥加壓,然后將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞從常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)皿中消化,吹打均勻,通過注射泵導(dǎo)入芯片的各縱列細(xì)胞培養(yǎng)腔,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。每24h通過注射泵更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液,注射泵流速為0.2μL/s,進(jìn)樣10min,以保證細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的營養(yǎng)更新和代謝物的排除。1.5藥物作用細(xì)胞芯片細(xì)胞培養(yǎng)72h后,關(guān)閉芯片的細(xì)胞進(jìn)樣口和縱向閥,橫向閥加壓,芯片藥物梯度濃度網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)進(jìn)樣口注入含藥物CTP-11(濃度為100μg/mL)的培養(yǎng)液,另一個(gè)進(jìn)樣口注入無藥物的培養(yǎng)液,2個(gè)進(jìn)樣口的進(jìn)樣速率為0.2μL/s,進(jìn)樣10min。藥物作用細(xì)胞24h后,用PBS除去藥物溶液。芯片內(nèi)各個(gè)培養(yǎng)腔的細(xì)胞活性和藥物對細(xì)胞的作用是通過LIVE/DEADViability/CytotoxicityKit熒光試劑盒(Molecularprobes)進(jìn)行檢測。對芯片待檢測的細(xì)胞,先通入PBS清洗,再通入含2μmol/LCalceinAM和4μmol/Lethidiumhomodier-1(EthD-1)的熒光染料混合液在室溫下孵育30min,然后在熒光顯微鏡(Olympus,IX51)下觀察并拍照,拍照的圖片用圖像分析軟件(ImageProPlus6.0,mediacybernetics)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2結(jié)果與討論2.1實(shí)驗(yàn)應(yīng)用設(shè)備通過微加工技術(shù)制作微流控芯片的模具可以由硅片、玻璃和SU-8負(fù)光刻膠等材料制作。SU-8負(fù)光刻膠可以制作高深寬比的厚膜圖形,以及它良好的力學(xué)性能和抗化學(xué)腐蝕性,而且它可以通過多次光刻形成臺階形多層結(jié)構(gòu)復(fù)雜的圖形,這是硅片和玻璃等材料不能與之媲美的,因此基于SU-8負(fù)光刻膠加工模具的技術(shù)在微尺寸的微流控領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)的芯片模具采用“兩次曝光,一次顯影”的方法制作雙層結(jié)構(gòu)的SU-8模具,該方法簡便易行、經(jīng)濟(jì)耐用。本實(shí)驗(yàn)中通過雙層PDMS與玻璃鍵合制作微流控細(xì)胞陣列芯片。PDMS是目前微流控技術(shù)中被廣泛采用的一種材料,由于其具有很好的透氣性,因此在PDMS芯片細(xì)胞生長時(shí)所需要的氧氣完全可以通過PDMS的通透性獲得,而不需要在培養(yǎng)液中溶解氧氣,且PDMS具有良好的透光性和生物相容性,有利于芯片內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)時(shí)觀察。此外通過熱化學(xué)反應(yīng),兩層未完全固化的PDMS之間的界面發(fā)生交聯(lián),完成兩層PDMS的鍵合,這種方法的粘合牢固,可以承受6×105帕以上的壓力。雙層PDMS構(gòu)成控制閥,實(shí)現(xiàn)了對微流控芯片的流體的控制,增加了實(shí)驗(yàn)芯片的功能和操控性。最終制成的微流控細(xì)胞陣列芯片如圖4所示,芯片只有一片普通載玻片的大小,芯片內(nèi)通道的總體積約為5μL,在細(xì)胞藥物實(shí)驗(yàn)中所需的培養(yǎng)液和藥物的消耗為微升數(shù)量級,這大大降低了藥物篩選的實(shí)驗(yàn)成本。2.2濃度梯度網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)微流控芯片的藥物濃度梯度的形成機(jī)制是基于微通道的層流的擴(kuò)散混合效應(yīng)。細(xì)胞陣列芯片的藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)具有5級濃度梯度通道,細(xì)胞培養(yǎng)液和含一定藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)混合液通過注射泵和連接管以相同的流速分別從2個(gè)進(jìn)樣口注入,液流先分為2支相同濃度的分流,其中相鄰的2支分流在通道中間混合、擴(kuò)散,組合成新的濃度的液流進(jìn)入下一級,在第二級通道網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成3種不同濃度的液流分支。這樣不同濃度的液流不斷地分流、混合、擴(kuò)散,形成新的濃度的液流,芯片最終產(chǎn)生6個(gè)濃度梯度的細(xì)胞培養(yǎng)混合液。濃度梯度通道采用半徑為50μm的半圓波浪型通道,這樣的結(jié)構(gòu)可以加強(qiáng)微流控通道的層流效應(yīng),可以使藥物濃度產(chǎn)生更好的混合效果。實(shí)驗(yàn)采用與藥物伊立替康分子量(677.19)相近的熒光染料羅丹明B(479.0175,AcrosOrganics公司)代替藥物進(jìn)行芯片的藥物濃度梯度的表征實(shí)驗(yàn)。將含有1mmol/L羅丹明B的細(xì)胞培養(yǎng)液和純細(xì)胞培養(yǎng)液通過注射泵以0.2μL/min的相同流速從進(jìn)樣口同時(shí)進(jìn)入芯片濃度梯度網(wǎng)絡(luò),2h后,濃度梯度網(wǎng)絡(luò)形成穩(wěn)定的梯度濃度羅丹明B溶液,用熒光顯微鏡拍照6個(gè)管道的熒光圖片(圖5),用圖像分析軟件ImageProPlus6.0分析每個(gè)通道的相對熒光值(虛線上通道平均熒光值減去背景平均熒光值),從而得到6個(gè)通道的羅丹明B濃度(0、0.212、0.523、0.668、0.769和1.0mmol/L)。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知,芯片的藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)可以產(chǎn)生6個(gè)具有一定線性的不同濃度藥物溶液同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)腔,刺激細(xì)胞。2.3細(xì)胞陣列芯片的作用細(xì)胞進(jìn)樣時(shí)在芯片內(nèi)的分布是通過芯片培養(yǎng)腔的C型壩結(jié)構(gòu)的物理攔截來實(shí)現(xiàn)的。壩頂部與玻璃層之間構(gòu)成一個(gè)高度為5μm的狹縫,而細(xì)胞的直徑一般為10~20μm,因此,細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)腔,由于狹縫的攔截作用和微流體的流動(dòng),細(xì)胞只分布在培養(yǎng)腔的中心區(qū)域,即C型壩內(nèi),而其他區(qū)域的細(xì)胞會(huì)隨著流體流走,這樣細(xì)胞陣列芯片可以有效地控制進(jìn)樣細(xì)胞的分布區(qū)域,以便觀察和分析。圖7a為細(xì)胞進(jìn)樣時(shí)在培養(yǎng)腔的分布,進(jìn)樣的細(xì)胞都被捕獲在壩的縫隙了,當(dāng)壩的縫隙布滿了細(xì)胞后,細(xì)胞不再進(jìn)入壩內(nèi),流向下一行的培養(yǎng)腔,這樣每一行的細(xì)胞進(jìn)樣數(shù)目基本相同,這樣有利于提高細(xì)胞分析的可比性和準(zhǔn)確性。因此芯片的壩結(jié)構(gòu)對細(xì)胞具有很好的攔截作用,而且可以很好地模擬組織細(xì)胞培養(yǎng)生長的微環(huán)境。三種細(xì)胞(癌細(xì)胞SMMC7721、正常肝細(xì)胞HL-7702和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-2C)在芯片閥控制層的作用下分別進(jìn)入不同列的細(xì)胞培養(yǎng)腔,待細(xì)胞貼壁后,除去閥作用,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的共培養(yǎng)。3種不同的細(xì)胞可以在物理上保持獨(dú)立性,同時(shí)可以通過液體流動(dòng)保持彼此的聯(lián)系和相互作用,這樣的細(xì)胞共培養(yǎng)可以簡單實(shí)現(xiàn)一個(gè)生理組織(如肝癌組織)的體外模擬培養(yǎng)。圖7通過對芯片各個(gè)培養(yǎng)腔細(xì)胞的熒光照片進(jìn)行分析,在芯片內(nèi)3種細(xì)胞的活性都可在95%以上,表明了該芯片內(nèi)的細(xì)胞的生長狀態(tài)良好,適宜進(jìn)行相關(guān)的細(xì)胞研究。2.4ctp-11對不同藥物作用細(xì)胞生長和凋亡的影響從芯片藥物濃度梯度的表征實(shí)驗(yàn)可知,當(dāng)通入濃度為100μg/mL的CTP-11溶液,芯片可形成6個(gè)一定梯度的藥物濃度作用芯片培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞(0、21.2、52.3、66.8、76.9和100μg/mL),細(xì)胞的活性分別