海洋海域尖刺擬楔形藻的生長增殖特征

海洋海域尖刺擬楔形藻的生長增殖特征

甲殼動物-納米海藻是一種常見的海海藻，也是形成副作用的主要藻類之一。在20世紀(jì)80年代以前,一般都認(rèn)為硅藻赤潮并不產(chǎn)生毒素,只是角毛藻中的某些種類會對養(yǎng)殖魚類造成物理性的損傷,導(dǎo)致魚類死亡。真正對硅藻特別是擬菱形藻的重視開始于1987年,這一年在加拿大的愛德華王子島(PrinceEdwardIsland)發(fā)生一起由于食用當(dāng)?shù)睾Ｓ蚺囵B(yǎng)的貽貝Mytilusedulis而引起的中毒事件,造成3人死亡,100多人中毒。經(jīng)研究,引起中毒的物質(zhì)是神經(jīng)毒素-多莫酸(DomoicAcid,DA),它是由多列擬菱形藻Pseudo-nitzschiamultiseries產(chǎn)生的。由DA引起的貝類毒素稱為記憶缺失性貝毒(AmnesicShellfishPoisoning,ASP),癥狀包括:嘔吐、腹瀉、神智不清、喪失記憶等,最嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。這次事件以后,世界的其它地區(qū)又陸續(xù)報道人類或其它動物的DA中毒事件,事件的元兇均是擬菱形藻屬的種類。尖刺擬菱形藻是中國沿海普遍存在的浮游生物種類,并且也是重要的赤潮生物種類,在大連、膠州灣、長江口、廈門港及南海各港灣都引起過赤潮。據(jù)報道,我國的南海海域夏季硅藻類約占75.7%,冬季硅藻類約占95.8%,主要優(yōu)勢種類為伏氏海毛藻、尖刺擬菱形藻、柔弱擬菱形藻等。而目前國內(nèi)對于尖刺擬菱形藻的研究主要以自然生態(tài)特征和分類學(xué)研究為主,營養(yǎng)生理方面的研究較少,所以加強(qiáng)對尖刺擬菱形藻的營養(yǎng)因子研究,研究有關(guān)生態(tài)因子對它們增殖的影響,對于了解赤潮發(fā)生機(jī)理具有重要意義,對研究我國南海海域赤潮的發(fā)生具有指導(dǎo)作用。1材料和方法1.1實驗藻種的制備實驗用藻種尖刺擬菱形藻Pseudo-nitzschiapungens分離自廣東大亞灣,經(jīng)純化后培養(yǎng)于暨南大學(xué)藻種室。實驗前將處于對數(shù)生長期的實驗藻種離心,用不添加任何培養(yǎng)基的人工海水清洗3次,然后在人工海水中饑餓培養(yǎng)2d,以此作為實驗藻種用于實驗種源。實驗用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),其中的N、P濃度按實驗要求添加。1.2光照度d采用100mL錐形燒瓶置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。溫度(20±1)℃,光照度(日光燈)約4000lx,光暗比L∶D為12h∶12h。藻種培養(yǎng)用人工海水配置的f/2加富培養(yǎng)液,實驗用人工海水按照Harrison配方配制(鹽度為28‰)。1.3角瓶培養(yǎng)方為減少其他元素對實驗的干擾,所用玻璃器皿均在w=5%稀HCl中浸泡過夜,用雙蒸水沖洗干凈后備用。培養(yǎng)用三角瓶在做上述處理后,雙蒸水清洗,最后在160℃下干熱滅菌。恒溫光照培養(yǎng)箱(LRH-400-GⅡ),照度儀(LocorModelLI185meter,2πcollector),顯微鏡(OlympusCH30),電子天平(SartoriusBS210S),計數(shù)框等。1.4n源濃度對pnnmr表達(dá)的影響在人工海水中加入除N、P之外的所有f/2培養(yǎng)基的其他成分,然后根據(jù)赤潮高發(fā)區(qū)N、P濃度的平均值,設(shè)置P(NaH2PO4·2H2O)濃度為0.65μmol·L-1,各N源濃度按設(shè)定濃度添加;設(shè)置N(NaNO3)濃度為40.0μmol·L-1,各P源濃度按設(shè)定濃度添加。實驗用f/2培養(yǎng)基用人工海水配制,鹽度為28‰,其中分別以NaNO3和NaH2PO4作為N源和磷源,其濃度按下表的梯度分別配制(表1)。1.5繪制生長曲線在顯微鏡下用計數(shù)框隔天計數(shù),每瓶計數(shù)2次,取平均值,記錄20d左右,以時間為橫坐標(biāo),每1mL液體中的細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。1.6培養(yǎng)時間的計算按照公式生長率u=(lnN2-lnN1)/(t2-t1)計算,其中t1、t2為培養(yǎng)時間;N2和N1分別為培養(yǎng)t2和t1時間的細(xì)胞密度。1.7最大生長率從上述生長率曲線中分別找出最大生長率的點進(jìn)行比較,比較哪個c(N)/c(P)梯度濃度下生長較好。2結(jié)果2.1生長情況在10、16、p時,N濃度梯度下,尖刺擬菱形藻種群數(shù)量增長由高到低梯度對應(yīng)c(N)/c(P)分別為32、16、10、5、100、200、1、0。c(N)/c(P)在0、1、5時,沒有明顯的指數(shù)性生長,增長達(dá)到一定數(shù)量后,生長平緩,隨后衰退;c(N)/c(P)在10、16、32時增長良好,基本維持在較高數(shù)量水平;c(N)/c(P)在100、200時生長也較為緩慢(圖1)。對各個N濃度梯度下尖刺擬菱形藻的最大細(xì)胞密度均值的統(tǒng)計分析表明,c(N)/c(P)在10、16、32時的最大細(xì)胞密度與對照組差異極顯著(P<0.01),而c(N)/c(P)在1、5、100、200時的最大細(xì)胞密度與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。2.2不同梯度種群的生長由圖2顯示,c(N)/c(P)在0、1、5、100、200的種群在培養(yǎng)的前5d細(xì)胞處于潛伏期,從第5天開始,進(jìn)入對數(shù)生長時期,到第9～13天時,細(xì)胞數(shù)陸續(xù)升至最高值,此后,細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期和衰亡期,細(xì)胞數(shù)開始緩慢下降,種群數(shù)量增長由高到低對應(yīng)c(N)/c(P)分別為200、100、5、1、0。而c(N)/c(P)在10、16、32的種群在17d時仍維持較高水平,有較顯著的增長趨勢,明顯優(yōu)于其它梯度種群的生長。對各個P濃度梯度下尖刺擬菱形藻的最大細(xì)胞密度均值的統(tǒng)計分析表明,c(N)/c(P)在32、100時的最大細(xì)胞密度與對照組差異極顯著(P<0.01),c(N)/c(P)在10、16時的最大細(xì)胞密度與對照組差異顯著(P<0.05),而c(N)/c(P)在1、5、200時的最大細(xì)胞密度與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。2.3生長率曲線圖3、圖4為尖刺擬菱形藻在不同的氮,磷濃度梯度下的生長率曲線。由圖中可以看出,在培養(yǎng)的前期(即前10d),尖刺擬菱形藻有較高的生長率,而到了10d以后,生長率下降,甚至變?yōu)樨?fù)值。2.4培養(yǎng)基c/n的濃度對尖刺擬三角形藻生長的影響圖5、圖6為尖刺擬菱形藻在不同的氮,磷濃度梯度下的最大生長率?？梢钥闯?培養(yǎng)基的c(N)/c(P)在10、16、32時,尖刺擬菱形藻有相對較大的最大增長率,顯示在這些c(N)/c(P)濃度下,尖刺擬菱形藻的增長較好,為相對適宜的生長環(huán)境。3分析與討論3.1營養(yǎng)型藻類的群落特征由N濃度梯度下的生長曲線可以看出,在固定磷濃度為0.65μmol·L-1,氮濃度較低(0、0.65、3.25μmol·L-1)的培養(yǎng)條件下,尖刺擬菱形藻種群的增長幅度較小,種群在經(jīng)過短暫的幾天對數(shù)生長后,很快停滯生長,甚至進(jìn)入衰亡期,這種消退主要與N的迅速耗盡有關(guān),此時P供應(yīng)量充足,N成為限制增長因子;而在氮濃度較高(6.50、10.4、20.8μmol·L-1)的培養(yǎng)條件下,種群增長較好,N、P比例恰當(dāng),能較好地維持藻細(xì)胞的增殖;而在氮濃度過高(65.0、130.0μmol·L-1)的培養(yǎng)條件下,種群增長也無明顯的隨氮濃度的增加而增長,反而出現(xiàn)抑制,這主要與P的迅速耗盡有關(guān),此時N供應(yīng)量充足,P成為限制因子。同樣,在固定氮濃度為40μmol·L-1,在濃低度磷(0、0.2、0.4μmol·L-1)的培養(yǎng)條件下,由于N供應(yīng)量充足,P成為生長限制因子;在適合的P濃度(1.25、2.5、4.0μmol·L-1)培養(yǎng)條件下,由于N、P比例恰當(dāng),生長快速;而在P含量過高(8.0、40μmol·L-1)的培養(yǎng)條件下,由于P供應(yīng)量充足,N成為限制因子。有研究指出赤潮藻類可分為三型,即營養(yǎng)(N、P)型、微量元素(Fe、Mn)型和特殊有機(jī)物(維生素,蛋白質(zhì))型。根據(jù)實驗結(jié)果,我們可以看出,擬菱形藻對N、P營養(yǎng)依賴較強(qiáng),故可將尖刺擬菱形藻劃歸為營養(yǎng)型藻類。結(jié)合到大亞灣的海洋生態(tài)特征,丘耀文對大亞灣營養(yǎng)物質(zhì)變異特征的研究,以及陳菊芳等對大亞灣海域擬菱形藻種群的季節(jié)變化及其與環(huán)境因子之間關(guān)系的研究均認(rèn)為N、P、Si等營養(yǎng)鹽含量對擬菱形藻的生長起決定作用,且擬菱形藻對水域中N、P、Si等營養(yǎng)鹽含量的要求不高,大亞灣海域天然水體內(nèi)缺磷現(xiàn)象往往比缺氮現(xiàn)象更嚴(yán)重、更普遍。因此,大亞灣水域?qū)儆赑限制,磷的供給具有更大的重要性。張誠等對尖刺擬菱形藻的增殖特征研究中也發(fā)現(xiàn),該藻吸收無機(jī)氮的能力在浮游植物中是較強(qiáng)的,這可能使其在與其他種類競爭氮時處于有利的位置而成為優(yōu)勢種,乃至形成赤潮。而其吸收磷的能力則較弱,故磷有可能是自然環(huán)境中限制因子。3.2營養(yǎng)鹽比例對擬三角形藻生長的影響藻類的生長除了與水體中氮、磷等營養(yǎng)鹽濃度密切相關(guān)以外,還與它們之間的比值關(guān)系密切。不同水域由于情況的不同,往往具有不同的c(N)/c(P)比值,雖然浮游植物對營養(yǎng)鹽的吸收利用大致遵循Redfield的c(N)/c(P)比定律(16∶1),但最佳c(N)/c(P)比也會因浮游植物種類的不同而變化。Hodgkiss等分析了1982—1989年間香港吐露港海水c(N)/c(P)比值與赤潮發(fā)生次數(shù)的關(guān)系,認(rèn)為營養(yǎng)鹽比例(例如氮磷比值)是赤潮事件更為重要的調(diào)控因素。本實驗的N、P比值設(shè)計變化范圍較大,分別為0、1、5、10、16、32、100、200。由實驗結(jié)果來看,不管在固定N還是固定P的實驗里,c(N)/c(P)在0、1、5等低濃度和c(N)/c(P)在100、200高濃度下,尖刺擬菱形藻的生長都明顯受到限制;而在c(N)/c(P)為10、16、32的培養(yǎng)基里有明顯的增長優(yōu)勢,顯示c(N)/c(P)在10～32范圍內(nèi)對擬菱形藻有顯著的促進(jìn)作用,超出這個范圍,擬菱形藻的生長就會受到抑制。陳菊芳等對大亞灣擬菱形藻種群的生態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示,當(dāng)?shù)妆却笥?0時,擬菱形藻生長明顯受到限制,而但當(dāng)?shù)妆鹊椭?.21時,擬菱形藻的生長也開始受到限制,認(rèn)為主要是由于N、P、Si等營養(yǎng)鹽,尤其是N由于藻類大量繁殖而耗盡所致。本研究的結(jié)果和上述自然生態(tài)中擬菱形藻種群的生態(tài)學(xué)特征的研究結(jié)果基本相符。4擬三角形藻的增殖能力本文通過氮、磷營養(yǎng)鹽限制下與尖刺擬菱形藻的生長關(guān)系的研究表明:尖刺擬菱形藻對氮、磷依賴性較強(qiáng),屬于營養(yǎng)型藻類;c(N)/c(P)在10～32時為尖刺擬菱形藻的生長最適范圍,已接近或達(dá)到尖刺擬菱形藻生長的飽和濃度,在此c(N)/c(P),擬菱形藻能快速增長,;而c(N)/c(P)<5或c(N)/c(P)>100時,該藻明顯受到抑制,該藻的生理活動