豬鏈球菌2型人工感染對(duì)balbc小鼠的致病作用

豬鏈球菌2型人工感染對(duì)balbc小鼠的致病作用

豬鏈霉菌2號(hào)在世界許多國(guó)家都有報(bào)道。近年來(lái)，這種疾病在中國(guó)的危害日益增強(qiáng)。一些豬關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)癥狀和并發(fā)癥在一些車間出現(xiàn)。一些人導(dǎo)致當(dāng)?shù)馗腥竞彤?dāng)?shù)厝烁腥?。豬鏈球菌2型的致病性與它的毒力因子關(guān)系密切,其毒力因子比較復(fù)雜,有溶菌酶釋放蛋白(MRP)、細(xì)胞外因子(EF)、溶血素和莢膜等,其中MRP、EF是許多致病性強(qiáng)毒株擁有而許多非致病性菌株沒(méi)有的2個(gè)重要毒力因子。豬鏈球菌2型以常在菌的形式存在豬體某些部位,如扁桃體等。調(diào)查結(jié)果表明,從非疫區(qū)健康豬扁桃體所分離的豬鏈球菌2型菌多呈MRP-、EF-,而從疫區(qū)健康豬分離的多呈MRP+、EF+。通常認(rèn)為該菌對(duì)豬、兔、山羊敏感,而對(duì)普通小白鼠、雛雞、雛鴨、豚鼠等不敏感。該菌的動(dòng)物致病性研究是對(duì)其毒力因子研究和疫苗研究的基礎(chǔ),為此我們選擇了不同來(lái)源和不同MRP、EF表現(xiàn)型的5個(gè)菌株,對(duì)它們進(jìn)行了BALB/c小鼠、豬、兔和普通小白鼠的致病性試驗(yàn)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1子表現(xiàn)型及毒力因子SS2-1、SS2-H、SS2-006444株:均分離自發(fā)病豬內(nèi)臟器官和組織,毒力因子表現(xiàn)型SS2-1、SS2-H株均為MRP+、EF+,SS2-006444株為MRP-、EF-;SS2-7株:分離于健康豬扁桃體,毒力因子表現(xiàn)型為MRP-、EF-;SS2-N株:從國(guó)內(nèi)引進(jìn)的參考株,毒力因子表現(xiàn)型為MRP+、EF*(為EF的類似物)。1.1.2體重5gBALB/c小鼠:購(gòu)自南京軍事醫(yī)學(xué)研究所,小鼠體重15—20g;豬、普通小白鼠、兔:均為本所豬場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供,豬體重為50日齡,小白鼠體重為20g,兔體重為1.5—2.0kg。1.1.3h,h以單個(gè)菌落接種含2.0g/L葡萄糖、10mL/L牛血清的馬丁肉湯,37.5℃培養(yǎng)18—20h;在進(jìn)行人工感染前取細(xì)菌培養(yǎng)原液0.1mL加入滅菌生理鹽水0.9mL,依次稀釋至10-6,然后取0.2mL菌液涂布于已制備的血瓊脂或巧克力瓊脂平皿,在37℃培養(yǎng)18—20h后計(jì)算平皿上生長(zhǎng)菌落,以其菌落數(shù)乘以0.5×107即為活菌濃度(CPU)。1.2方法1.2.1豬同劑量注射組豬:試驗(yàn)用豬12頭,分為6組,2頭/組,CPU依次為13.3×108/mL(原液組)、13.3×107/mL、13.3×106/mL、13.3×105/mL、13.3×104/mL和對(duì)照組,均為豬耳靜脈注射,1mL/頭,對(duì)照組豬同劑量注射滅菌生理鹽水。兔和普通小白鼠:將培養(yǎng)菌液CPU調(diào)為8.0×108/mL,分別于兔背部皮下及小白鼠腹腔注射,1mL/只,2只/組。BALB/c小鼠:試驗(yàn)用小鼠10只,分為5組,2只/組,CPU依次為6.5×108/mL(原液組)、6.5×107/mL、6.5×106/mL、6.5×105/mL和對(duì)照組,均采用腹腔注射,1mL/只,對(duì)照組小鼠同劑量注射滅菌生理鹽水。1.2.2小鼠的攻毒試驗(yàn)將SS2-H、SS2-006444、SS2-7、SS2-N株菌液CPU分別調(diào)至9.8×108/mL、5.3×108/mL、9.4×108/mL、2.8×108/mL,定為各組的各株菌原液組,再將各株菌CPU按1∶10、1∶100、1∶1000稀釋,同時(shí)設(shè)各株菌的對(duì)照組,2只/組,1mL/只,腹腔注射,對(duì)照組注射同劑量滅菌生理鹽水。于攻毒后21—40d對(duì)部分耐過(guò)BALB/c小鼠用SS2-1株菌液CPU為3.5×107/mL腹腔注射,1mL/只,同時(shí)設(shè)2只小鼠為攻毒對(duì)照組。以上試驗(yàn)動(dòng)物于攻毒后觀察其死亡、癥狀等,觀察21d;對(duì)死亡動(dòng)物取心血接種血平板分離培養(yǎng),進(jìn)行菌落形態(tài)和革蘭氏染色等方法鑒定。2結(jié)果2.1sd-1對(duì)四種動(dòng)物的疾病2.1.1豬s2-1對(duì)豬的致病性將不同稀釋度SS2-1接種試驗(yàn)豬后,在試驗(yàn)期內(nèi)CPU為13.3×108/mL(原液)組死亡2頭;13.3×107/mL組死亡2頭;13.3×106/mL組1頭豬無(wú)明顯變化,另1頭豬于2—6d出現(xiàn)跛行、減食等,以后癥狀消失;13.3×105/mL組1頭豬無(wú)變化,另1頭豬在2d出現(xiàn)跛行于第6d癥狀消失,并出現(xiàn)頭偏向一側(cè)的神經(jīng)癥狀;13.3×104/mL組和對(duì)照組豬均表現(xiàn)正常。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,SS2-1株對(duì)豬有致病性,經(jīng)計(jì)算LD50為4.2×107;ID50為1.33×106。同時(shí)從病死豬內(nèi)臟分離到與接種菌相同的細(xì)菌。2.1.2小鼠接種后感染用CPU為8.0×108/mL接種兔和普通小白鼠,接種后兔和普通小白鼠僅出現(xiàn)一過(guò)性精神萎頓,6h后即恢復(fù)正常。結(jié)果顯示,兔和普通小白鼠對(duì)SS2-1株不敏感。2.1.3ss2-1對(duì)balb/c小鼠有較高的抗性用SS2-1株CPU不同稀釋度接種BALB/c小鼠,接種后最低至1∶100稀釋度組小鼠均出現(xiàn)死亡,表明SS2-1株對(duì)BALB/c小鼠有較高的敏感性。結(jié)果見(jiàn)表1。2.2表1顯示了sd2-h、sso2-00744、sso2-7和ss2-n對(duì)bb-c大鼠的敏感結(jié)果2.3小鼠懸液攻擊ss2將部分耐過(guò)SS2-N、SS2-1、SS2-0064444株攻擊的BALB/c小鼠用致死量SS2-1株懸液接種,其中耐過(guò)SS2-N和5.3×107/mLSS2-006444組的BALB/c小鼠對(duì)SS2-1株攻擊具有明顯的保護(hù)率(100%),結(jié)果見(jiàn)表2。3對(duì)balb/c小鼠的致病性3.1豬鏈球菌2型可以人工感染豬和BALB/c小鼠,引起發(fā)病;其MRP和EF毒力因子的表現(xiàn)型與其對(duì)BALB/c小鼠的致病性無(wú)相關(guān)關(guān)系。3.2本試驗(yàn)結(jié)果顯示:SS2-1株對(duì)兔不敏感,這與許多報(bào)道不一致,可能是此菌株的1個(gè)特性;而對(duì)普通小白鼠不致病則與其它報(bào)道一致。3.3從病豬分離