油小球藻chl的分離篩選及產(chǎn)油工藝優(yōu)化

油小球藻chl的分離篩選及產(chǎn)油工藝優(yōu)化

隨著世界經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，全球?qū)r漿巖能源的需求和消耗迅速增加，我們必須調(diào)整能源的發(fā)展。我國(guó)作為第二大能源消費(fèi)國(guó),石油短缺已經(jīng)成為制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要因素之一。生物柴油與化石柴油相比具有運(yùn)動(dòng)粘度高、閃點(diǎn)高、抗爆性能優(yōu)良、環(huán)境友好、可再生等優(yōu)點(diǎn),是最具潛力的替代能源。微藻具有生長(zhǎng)周期短、易工業(yè)化培養(yǎng)以及脂類(lèi)物質(zhì)含量高等優(yōu)點(diǎn),是制備生物柴油的良好材料,以藻類(lèi)制備生物柴油已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)產(chǎn)油微藻的研究以異養(yǎng)培養(yǎng)為主。這使得以微藻為原料生產(chǎn)生物柴油培養(yǎng)成本和能耗較高,同時(shí)還會(huì)增加CO2排放。自養(yǎng)產(chǎn)油微藻可以在廉價(jià)光能作用下將氮源和無(wú)機(jī)碳源等營(yíng)養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化成生物量和油脂等高附加值產(chǎn)品,而且其生產(chǎn)相對(duì)綠色環(huán)保,可以有效解決異養(yǎng)培養(yǎng)存在的問(wèn)題,開(kāi)發(fā)高油脂含量且生長(zhǎng)迅速的藻種具有重要意義,是將微藻應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的前提。但國(guó)內(nèi)關(guān)于產(chǎn)油微藻的自養(yǎng)培養(yǎng)鮮有報(bào)道。本文通過(guò)人工分離得到自養(yǎng)生長(zhǎng)的產(chǎn)油微藻,并就氮源與無(wú)機(jī)碳源(碳酸氫鈉)對(duì)其自養(yǎng)生長(zhǎng)和油脂積累的影響進(jìn)行研究,以期為自養(yǎng)產(chǎn)油微藻的進(jìn)一步研究及大規(guī)模培養(yǎng)提供參考。1材料和方法1.1單一藻種的制備取5mL云南滇池水樣,10000r/min離心10min棄去上清液。補(bǔ)加水樣至5mL,重復(fù)操作2次,得混合樣品沉淀,后用無(wú)菌水定容至5mL,混勻,得到相對(duì)高濃度的藻液。將制得的藻液,以10%(V/V接種量接種到30mLSE培養(yǎng)液中,于光照強(qiáng)度4000lux、溫度25°C的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d,再以10%(V/V)接種量接種于新鮮SE培養(yǎng)基中,連續(xù)轉(zhuǎn)接10次。然后將得到的藻液逐步稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍,取后3個(gè)梯度涂布,倒置于光照培養(yǎng)箱,培養(yǎng)條件同上。后挑取單一藻種接種到SE培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件同上,后稀釋涂布。循環(huán)操作3次,最后得到所需的藻株。1.2土壤樣品,土壤提取液SE培養(yǎng)液:NaNO3250mg,K2HPO4·3H2O75mg,MgSO4·7H2O75mg,CaCl2·2H2O25mg,KH2PO4175mg,NaCl25mg,土壤提取液40mLFeCl3·6H2O5mg,Fe-EDTA1mL,A5液1mL,蒸餾水958mL。1.3培訓(xùn)方法1.3.1無(wú)氮體培養(yǎng)基以培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的藻液為種子培養(yǎng)液,調(diào)整使其起始濃度相同,以10%(V/V)接種量接種于無(wú)氮SE培養(yǎng)基,并添加碳酸氫銨、硝酸鈉、尿素使氮元素濃度為41mg/L,置于光照強(qiáng)度為4000lux、150r/min、25°C的搖床中培養(yǎng)28d。1.3.2硝酸鈉濃度對(duì)水培養(yǎng)液培養(yǎng)的影響取種子培養(yǎng)液以10%(V/V)接種量接種于無(wú)氮SE培養(yǎng)基,分別添加硝酸鈉濃度為41、123、615、1230和2460mg/L,培養(yǎng)條件同1.3.1。1.3.3nahco3濃度對(duì)se培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)的影響取種子培養(yǎng)液以10%(V/V)接種量接種于氮元素濃度為123mg/L的SE培養(yǎng)基,分別添加NaHCO3濃度為0、100、200、400、800、1200和1600mg/L培養(yǎng)條件同1.3.1。1.4微生物指標(biāo)的測(cè)定微藻細(xì)胞密度測(cè)定:采用紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定微藻溶液在680nm處的吸光值(OD680),并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)微藻個(gè)數(shù),建立微藻的細(xì)胞數(shù)與吸光度OD680的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),曲線(xiàn)方程如下:式中x為微藻的吸光值OD680,y為微藻細(xì)胞密度(×107cells/mL)。生物量的測(cè)定:在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期,取一定體積的藻液,離心(10000r/min,10min)收集藻細(xì)胞,雙蒸水洗滌2次后,10000r/min離心5min,經(jīng)冷凍干燥,稱(chēng)重,以單位體積干重表示其生物量。比生長(zhǎng)速率:比生長(zhǎng)速率可用來(lái)評(píng)價(jià)微藻在一定時(shí)期內(nèi)的總體生長(zhǎng)情況。公式如下:其中μ為比生長(zhǎng)速率,N1為接種時(shí)藻細(xì)胞密度N2為培養(yǎng)結(jié)束時(shí)藻細(xì)胞密度,t2-t1為藻液接種到培養(yǎng)結(jié)束的時(shí)間間隔。油脂含量測(cè)定:重量法;油脂含量=(油脂質(zhì)量/干藻粉質(zhì)量)×100%。油脂提取:氯仿甲醇法。2結(jié)果與討論2.1最大生物量產(chǎn)率及油脂含量多次分離純化后得到6株純微藻。將6株微藻于以尿素為氮源的SE培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件同1.3.1。不同藻種培養(yǎng)28d后的最大生物量產(chǎn)率、油脂含量及油脂產(chǎn)率結(jié)果如表1所示。從表1可以看到,5號(hào)藻種的最大生物量產(chǎn)率、油脂含量及油脂產(chǎn)率均最高,分別為101.8mg/(L·d)、28.1%、28.6mg/(L·d)。該藻為單細(xì)胞綠藻,球形,包含一個(gè)葉綠體,無(wú)性繁殖,參照《藻類(lèi)與環(huán)境保護(hù)》分類(lèi),初步鑒定可知該藻屬小球藻屬,建議命名為小球藻(Chlorellavulgaris)。選擇C.vulgaris為出發(fā)藻種進(jìn)行進(jìn)一步研究。2.2不同氮源對(duì)微藻生物量的影響氮源對(duì)微藻的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖及油脂的積累等生理活動(dòng)都有重要的影響。通?？梢员晃⒃謇玫牡从袖@鹽、硝酸鹽及尿素等,但在吸收速度與利用程度上有所差別。實(shí)驗(yàn)考察了碳酸氫銨、硝酸鈉、尿素等氮源對(duì)C.vulgaris生長(zhǎng)和油脂積累的影響(圖1、2及表2)。從圖1看出,與不添加氮源相比向培養(yǎng)液中添加3種不同氮源均有利于C.vulgaris的生長(zhǎng),其中尿素的促進(jìn)作用最強(qiáng)。C.vulgaris在不同氮源條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)和生長(zhǎng)周期相似(圖2),藻細(xì)胞密度尿素組高于硝酸鈉組和碳酸氫銨組,分別為13.6×107、12.2×107和9.7×107cells/mL。由表2可知,以硝酸鈉為氮源,C.vulgaris的最大生物量產(chǎn)率為93.3mg/(L·d),低于尿素的103.8mg/(L·d);但油脂含量為33.6%,高于尿素的28.9%,不添加氮源時(shí)油脂含量最高為40.2%。目前關(guān)于氮源對(duì)微藻生長(zhǎng)影響的研究認(rèn)為,不同氮源對(duì)于微藻各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響不同。胡章喜等研究表明,以尿素為氮源時(shí),B.braunii765的細(xì)胞密度最高(OD值為1.87),而以硝酸鹽為氮源時(shí),其生物量(2.15g/L)和總烴含量(27.89%)最高。本研究結(jié)果得到相似的結(jié)論,3種氮源相比,尿素最有利于C.vulgaris的生長(zhǎng),而硝酸鈉最有利于C.vulgaris的油脂積累。綜合考慮生物量產(chǎn)率和油脂含量,選擇硝酸鈉作為優(yōu)化氮源,此時(shí)的油脂產(chǎn)率最高為31.3mg/(L·d)(表2)。2.3氮元素濃度對(duì)c.vol-沙門(mén)氏菌細(xì)胞的影響微藻的培養(yǎng)過(guò)程中,氮元素濃度是影響微藻油脂積累的最主要因素之一。實(shí)驗(yàn)以硝酸鈉為氮源,研究了氮元素濃度對(duì)C.vulgaris生長(zhǎng)和油脂積累的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3、4及表3。圖3表明,隨著氮元素濃度的升高,C.vulgaris的比生長(zhǎng)速率先增大后減小,說(shuō)明高濃度氮元素對(duì)其生長(zhǎng)有一定抑制作用。這與尹翠玲等的報(bào)道相一致,原因可能是由于生長(zhǎng)后期,磷源被耗盡,氮/磷比例失調(diào),而藻細(xì)胞對(duì)氮源的過(guò)量吸收,不利于細(xì)胞的分裂。氮元素濃度為123mg/L時(shí),C.vulgaris的生物量最高為13.3×107cells/mL(圖4)。由表3可知,隨著氮元素濃度的增加,油脂含量趨于降低;最大生物量產(chǎn)率先增加后減少。當(dāng)?shù)貪舛葹?1mg/L時(shí),油脂含量可達(dá)33.5%,最大生物量產(chǎn)率為95.8mg/(L·d);氮元素濃度為123mg/L時(shí),油脂含量為32.4%,最大生物量產(chǎn)率為102.1mg/(L·d)。小球藻的油脂含量一般為8%-27%,本研究中出現(xiàn)較高油脂含量可能是由于當(dāng)?shù)枯^低時(shí),產(chǎn)油微生物的腺苷一磷酸(AMP)脫氨酶的酶量增加,AMP脫氨酶將AMP大量轉(zhuǎn)化為肌苷一磷酸(IMP)和氨,相當(dāng)于微生物對(duì)缺氮的一種應(yīng)激反應(yīng),而線(xiàn)粒體中異檸檬酸脫氫酶(ICDH)多為AMP依賴(lài)性脫氫酶,細(xì)胞內(nèi)AMP濃度的降低將減弱甚至完全停止該酶的活性。檸檬酸更多被檸檬酸裂解酶催化生成合成脂肪酸的原料乙酰輔酶A,從而使細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累量增加。鑒于氮元素濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂含量的積累具有相反的作用,綜合考慮生物量產(chǎn)率和油脂含量,確定優(yōu)化氮源濃度為123mg/L,此時(shí)的油脂產(chǎn)率最高為33.1mg/(L·d)。2.4不同初始濃度對(duì)c.vol-g-l-4和3.v保險(xiǎn)液ph的影響藻類(lèi)培養(yǎng)過(guò)程中由于受到CO2供應(yīng)速率的限制,使其生物量積累不高,適量添加NaHCO3可以促進(jìn)藻細(xì)胞生物量的增加。實(shí)驗(yàn)考察了不同NaHCO3濃度對(duì)微藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響(圖5、6及表4)。由于NaHCO3的加入會(huì)改變培養(yǎng)液的pH從而影響微藻的生長(zhǎng),因此實(shí)驗(yàn)還監(jiān)測(cè)了培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液的pH變化趨勢(shì)如圖7所示。如圖5顯示,隨著培養(yǎng)液中NaHCO3濃度的增加,C.vulgaris的比生長(zhǎng)速率先增大后減小,隨后又增大。原因可能是,當(dāng)NaHCO3的初始濃度小于400mg/L時(shí),培養(yǎng)液的pH始終低于9,適于C.vulgaris的生長(zhǎng),且NaHCO3的濃度越高越有利于微藻生長(zhǎng);當(dāng)NaHCO3初始濃度大于(等于)400mg/L時(shí),前3天培養(yǎng)液的pH在6-9之間(圖7),適于C.vulgaris的生長(zhǎng),且在短時(shí)間內(nèi)其生物量快速積累。5d后,培養(yǎng)液的pH高于9,對(duì)C.vulgaris的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。在藻類(lèi)培養(yǎng)中,NaHCO3不僅起到碳源的作用,而且起到緩沖劑的作用,一次性添加NaHCO3濃度過(guò)高時(shí),藻液pH偏堿性,薇藻生長(zhǎng)就會(huì)受到限制。這與李?lèi)?ài)芬等的研究報(bào)道相一致。當(dāng)NaHCO3濃度為200mg/L時(shí),C.vulgaris獲得了最大的細(xì)胞密度14.1×107cells/mL(圖6)。由表4可見(jiàn),隨著NaHCO3濃度的增加,C.vulgaris的油脂含量先增加后減少。NaHCO3的濃度為200mg/L時(shí),C.vulgaris油脂含量最高可達(dá)37.5%。雖然NaHCO3初始濃度大于(等于)400mg/L時(shí),C.vulgaris的生長(zhǎng)和油脂積累受到了抑制。但由于前4天的生物量積累迅速,顯著地提高了生物量的生產(chǎn)效率。當(dāng)NaHCO3初始濃度為1600mg/L時(shí),C.vulgaris培養(yǎng)5d的最大生物量產(chǎn)率為379.5mg/(L·d),油脂產(chǎn)率最高為107.0mg/(L·d)。NaHCO3初始濃度為800mg/L時(shí),C.vulgaris培養(yǎng)4d的最大生物量產(chǎn)率為332.8mg/(L·d),油脂產(chǎn)率為100.2mg/(L·d)。從經(jīng)濟(jì)和油脂生產(chǎn)的角度考慮,C.vulgaris的最佳NaHCO3濃度為800mg/L。在此濃度下,C.vulgaris的最大生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率分別是對(duì)照組的3.6和3.4倍。3氮元素濃度對(duì)c.vol-4和碳酸氫鈉穩(wěn)定性的影響(1)通過(guò)人工分離得到一株含