實驗三 血清γ-球蛋白的分離、純化及鑒定(七年制)

血清γ球蛋白的

分離純化與鑒定劉曉如1【實驗目的】1．學習鹽析法、凝膠層析和離子交換層析分離純化蛋白質的基本原理及應用2．掌握醋酸纖維薄膜電泳技術的原理及應用3．了解蛋白質分離純化的總體思路2

【實驗方法】

一、鹽析法粗分γ-球蛋白二、凝膠過濾方法脫鹽三、離子交換層析方法純化γ-球蛋白四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度

3【基本原理】

蛋白質的分離、純化及鑒定是研究蛋白質化學性質及生物學功能的重要手段之一。不同蛋白質的分子量、溶解度及在一定條件下，帶電的情況等都有所不同。利用這些性質的差別，可分離純化各種蛋白質。4分離蛋白質的方法分離方法沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電學法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析在分離純化時，根據(jù)情況選用幾種方法，相互配合才能達到分離純化一種蛋白質的目的。5【基本原理】

本實驗采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過濾、離子交換層析方法，分離純化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度。

6實驗思路分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定先粗后細離子交換層析純化7一、鹽析法粗分離血清γ-球蛋白

鹽析法是根據(jù)不同蛋白質在不同濃度的中性鹽溶液中溶解度不同，分別析出，達到彼此分離的方法。本實驗在半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白溶解，球蛋白將沉淀析出，經(jīng)離心所得的沉淀即為球蛋白的粗提液。8定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:

破壞蛋白質兩個穩(wěn)定因素：

水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點：蛋白質不變性，常用。鹽析法9鹽析步驟取離心管一支加入血清2ml加入2ml0.9%氯化鈉搖勻邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和(NH4)2SO44ml上清液（主要含清蛋白）傾去靜置10min，再離心（5000轉/分）10min沉淀用1ml0.9%氯化鈉攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO42ml,搖勻靜置10min，再離心（5000轉/分）10min傾棄上清液（主要含α、β球蛋白）沉淀即為初步純化的γ－球蛋白加入0.0175mol/L磷酸緩沖液（pH=6.3)1ml溶解γ－球蛋白粗提液10二、葡聚糖凝膠柱層析脫鹽

欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量鹽，通常有兩種方法：

凝膠層析法、透析本試驗采用葡聚糖凝膠——SephadexG25層析方法除去球蛋白粗提液中的鹽硫酸銨，以便下一步用離子交換層析方法進一步提純球蛋白。11凝膠層析原理：P31

凝膠層析法是按混合物各組分分子量大小不同隨流動相經(jīng)過層析柱的時間不同而被分離的技術。

凝膠是一類具有三維多孔網(wǎng)狀結構的干燥顆粒，當吸收一定量溶液后溶漲成柔軟、富有彈性、不帶電荷、不與溶質相互作用的惰性物質，凝膠層析以其為固定相。層析時，直徑大于凝膠網(wǎng)孔的大分子物質不能進入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動相向下移動，所以流程短、流速快，首先流出層析柱；而小分子物質直徑小于凝膠網(wǎng)孔能自由出入，洗脫時間長，后流出層析柱，經(jīng)過一定時間層析，分子大小不同的物質彼此分開，達到分離的目的。

12凝膠層析法脫鹽13凝膠柱層析脫鹽14分子篩層析15數(shù)學模型VoViVtVi—凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）Vo—顆粒間水（外水）Vg—凝膠體積總體積Vt=Vi+Vo+Vg16Kd

—分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行為，反映物質分子進入凝膠顆粒的程度，是溶質分子大小的一個函數(shù)Ve—洗脫體積：分離物被洗脫時所用的洗脫液體積Kd=(Ve-Vo)/Vi

洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標，各物質濃度/吸光度為縱坐標作圖17（1）完全被排阻的極端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，0<Kd<1（3）完全滲透的小分子，Ve=Vo+Vi，Kd=118▲SephadexG-25的準備▲裝柱（15~20cm）操作步驟：1、層析柱保持垂直。2、放蒸餾水，排出空氣，關閉出口。3、加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液，調節(jié)流速10滴/min，使凝膠均勻沉降，不斷補充，直至18cm。4、上留1-2mm的水，關閉出口。

注意：★床面上要保持少許水，防止膠床露出液面。

★膠面不平，用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降，使表面平整。19▲加樣與洗脫▲凝膠的再生1、加樣：用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開出口使樣品溶液滲入凝膠。2、洗脫：加入洗脫液，打開出口，保持流速10滴/min，收集洗脫液，每管收集1ml。用奈氏試劑檢測NH4+。3、保存：20%璜基水楊酸溶液檢測洗脫液的蛋白質，保存含量高的進一步純化

不斷加洗脫液，使NH4+全部流出，為下次實驗做準備20脫鹽

12345678910②上樣γ－球蛋白，粗提液①裝柱葡聚糖凝膠G-25，柱高18-20cm流速：每分鐘10滴左右

③加入洗脫劑④收集20滴換一支試管21⑤.層析后洗脫液檢測白色比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加奈氏試劑（檢測NH4+）,另一塊滴加20%璜基水楊酸（檢測蛋白質）。不用滴管,避免污染,直接倒…用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺⑥回收凝膠22注意事項：

1.凝膠柱的制備質量決定分離效果的好壞。

2.加樣分離時，滴速越慢，分離效果越好。★

以管號為橫軸，蛋白質含量為縱軸繪制洗脫曲線，分析實驗結果。23三、DEAE－纖維素離子交換層析

【實驗目的】

1.通過使用DEAE－纖維素離子交換層析法，進一步純化γ-球蛋白脫鹽液，得到較純的γ-球蛋白溶液

2.學習了解離子交換層析方法的基本原理和應用24離子交換層析的基本原理

離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離子交換劑達到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過化學反應將帶電基團引入到惰性支持物上形成的固體物質，在實驗中作為固定相。如果其帶負電，則能結合陽離子，成為陽離子交換劑；如果其帶正電，則能結合陰離子，稱為陰離子交換劑。可根據(jù)實驗需要，選擇不同的離子交換劑進行離子交換層析。

DEAE（二乙基氨基乙基）－纖維素含有可離子化的堿基，可與氫離子結合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。25DEAE－纖維素離子交換層析純化γ－球蛋白血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白的等電點為：清蛋白pI=4.64，

α2球蛋白

pI=5.06，

β球蛋白pI=5.12，

γ球蛋白pI=7.3本實驗采用0.0175mol/lpH6.5NH4Ac緩沖液進行洗脫。此pH，DEAE帶正電荷，可與帶負電荷的α、β-球蛋白和清蛋白結合，而帶正電荷的γ-球蛋白不與DEAE結合，首先從層析柱中洗脫出來，首先收集到的既是純化的γ-球蛋白。26操作將脫鹽后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同凝膠過濾），用0.0175mol/lpH6.3NH4Ac緩沖液洗脫，流速10滴～15滴/分，用小試管連續(xù)收集流出液（約1.0ml/管），用20%磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況，收集含量最高的部分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來的是γ－球蛋白。27１.使用離心機的操作注意事項。２.裝柱時檢查是否漏水。３.裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。４.柱床面保持有緩沖液。５.加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。６.每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被測樣品交叉污染。28四、γ－球蛋白純化液的濃縮

利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大分子蛋白進入微孔的特性，在樣品溶液