第九章聚合酶鏈反應(yīng)及相關(guān)技術(shù)

第九章聚合酶鏈反應(yīng)及相關(guān)技術(shù)第1頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月聚合酶鏈反應(yīng)于二十世紀(jì)80年代由K.Mullis建立，并和定點(diǎn)突變的發(fā)明者M(jìn).Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開(kāi)創(chuàng)了嶄新時(shí)代。第2頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)第3頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)第4頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）是DNA體外復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制相似第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)第5頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)一、PCR反應(yīng)原理、反應(yīng)過(guò)程和特點(diǎn)二、PCR的反應(yīng)體系三、PCR的反應(yīng)條件四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制第6頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程1.原理DNA的體外復(fù)制包括3個(gè)步驟：變性（denaturation）:94C～95C退火（annealing）:40C～70C

延伸（extension）:72C

第7頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月變性:DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈分子作為反應(yīng)的模板退火:引物與模板互補(bǔ)結(jié)合，形成雜交鏈延伸:按照模板鏈的序列以互補(bǔ)的方式依次把dNTP加至引物的3′端，TaqDNA聚合酶使雜交雙鏈不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程第8頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5’5’3’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入試管中添加反應(yīng)混合液及樣本變性一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程第9頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)延伸繼續(xù)延伸一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程第10頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二個(gè)循環(huán)4個(gè)拷貝第三個(gè)循環(huán)8個(gè)拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n個(gè)循環(huán)2n個(gè)拷貝一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程第11頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.特點(diǎn)特異性強(qiáng)引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性靈敏度高指數(shù)增長(zhǎng)，從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平簡(jiǎn)便、快速2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程第12頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、PCR的反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份:1.模板2.引物3.脫氧核苷三磷酸4.TaqDNA聚合酶5.鎂離子濃度6.其它反應(yīng)因素第13頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.模板（template）基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等RNA作為模板時(shí)，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng

反應(yīng)體系中較低量的模板有利于提高擴(kuò)增產(chǎn)量和減少非特異性擴(kuò)增二、PCR的反應(yīng)體系第14頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.引物(primer)化學(xué)合成的寡核苷酸與模板特異地結(jié)合決定產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度二、PCR的反應(yīng)體系第15頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)計(jì)引物的原則(一)兩條引物分別位于被擴(kuò)增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物濃度：0.1～0.2μmol/L，濃度過(guò)高容易生成引物二聚體二、PCR的反應(yīng)體系第16頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)計(jì)引物的原則(二)引物的堿基組成應(yīng)平衡，C+G堿基含量在引物中的比例一般以45%～55%為宜引物退火溫度計(jì)算：Tm=2（A+T）+4（C+G）引物的5′端可被修飾（引入酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記）二、PCR的反應(yīng)體系第17頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.脫氧核苷三磷酸（dNTP）

dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物反應(yīng)體系中各種核苷酸的濃度必須一致濃度過(guò)高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異性擴(kuò)增也隨之增加最適濃度：20～200μmol/L二、PCR的反應(yīng)體系第18頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.TaqDNA聚合酶

從一種生活在熱泉（80℃～90℃）中的水棲噬熱菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性二、PCR的反應(yīng)體系第19頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Taq酶的作用:在模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，在引物3′-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成3′,5′-磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5′→3′方向延伸，催化DNA合成最適酶量：1～2.5U二、PCR的反應(yīng)體系第20頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月TaqDNA聚合酶無(wú)3′→5′外切酶活性，因而無(wú)校正功能，在復(fù)制新鏈的過(guò)程中會(huì)發(fā)生堿基錯(cuò)配TaqDNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000，因此擴(kuò)增的片段越長(zhǎng)，錯(cuò)配的機(jī)率越高二、PCR的反應(yīng)體系第21頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月耐熱的高保真DNA多聚合酶：PwoDNApolymeraseTthDNApolymerasePfuDNApolymerase高熱穩(wěn)定性，高保真性，能降低堿基錯(cuò)配率二、PCR的反應(yīng)體系第22頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.鎂離子濃度對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影響PCR反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及鰲合劑均可與Mg2+結(jié)合，降低游離Mg2+的濃度，影響酶的活性dNTP濃度為200μmol/L時(shí)，MgCl2濃度為1.5mmol/L較宜二、PCR的反應(yīng)體系第23頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.其它反應(yīng)因素pH：反應(yīng)所需的最適pH值在7.2左右鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物與模板雜交基質(zhì)：牛血清白蛋白、明膠、Tween20、DTT等二、PCR的反應(yīng)體系第24頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、PCR的反應(yīng)條件

反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）2.反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）3.循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）4.PCR過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)第25頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.反應(yīng)溫度

變性溫度：94℃～97℃退火溫度：低于引物Tm5℃左右溫度過(guò)高：降低擴(kuò)增效率溫度過(guò)低：增加非特異性擴(kuò)增延伸溫度：72℃三、PCR的反應(yīng)條件

第26頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.反應(yīng)時(shí)間

第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間每一個(gè)步驟所需時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增三、PCR的反應(yīng)條件

第27頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.循環(huán)次數(shù)

一般設(shè)為25～35個(gè)循環(huán)每一個(gè)循環(huán)使一個(gè)分子的模板被復(fù)制為二個(gè)，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)三、PCR的反應(yīng)條件

第28頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一個(gè)分子的模板經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)，理論上即可得230(約109)個(gè)拷貝產(chǎn)物實(shí)際反應(yīng)中，每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增效率大多約為85%左右三、PCR的反應(yīng)條件

第29頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)：PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增25～35個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng)。三、PCR的反應(yīng)條件

第30頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月指數(shù)增長(zhǎng)期線形增長(zhǎng)期平臺(tái)期循環(huán)數(shù)

理論值

實(shí)際值Log產(chǎn)物DNA4.PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)三、PCR的反應(yīng)條件

第31頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月平臺(tái)出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺(tái)出現(xiàn)得越早平臺(tái)效應(yīng)產(chǎn)生的因素：引物二聚體的產(chǎn)生反應(yīng)體系各組分的消耗引物和已擴(kuò)增的DNA片段間的競(jìng)爭(zhēng)等三、PCR的反應(yīng)條件

第32頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制1.實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)第33頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.防污染體系：正確設(shè)置實(shí)驗(yàn)室、嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作、完整有效的去污染措施反應(yīng)體系中以dUTP取代dTTP，加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），破壞以往的擴(kuò)增產(chǎn)物每次實(shí)驗(yàn)完畢后須用1g/L次氯酸鈉清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，或用254nm波長(zhǎng)的紫外光近距離充分照射四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制第34頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.PCR技術(shù)的質(zhì)量保證基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的全過(guò)程的質(zhì)量保證分析前分析中分析后室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制第35頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第36頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)一、逆轉(zhuǎn)錄PCR二、定量PCR三、多重PCR四、PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變五、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA第37頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針，檢測(cè)RNA病毒、分析基因表達(dá)等第38頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA所用的引物：以PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物以人工合成的隨機(jī)序列（六核苷酸混合物）作為引物一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）第39頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、逆轉(zhuǎn)錄PCR第40頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、定量PCR(quantitativePCR)對(duì)DNA或RNA樣本的靶序列進(jìn)行定量分析主要用于基因表達(dá)的分析、病原體核酸的檢測(cè)等第41頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又稱實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)FQ-PCR通過(guò)熒光信號(hào)對(duì)PCR過(guò)程中的產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，精確計(jì)算出PCR的初始模板量二、定量PCR第42頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月熒光信號(hào)的檢測(cè)方法二、定量PCR1.DNA結(jié)合染料技術(shù)2.水解探針技術(shù)3.雜交探針技術(shù)4.分子信標(biāo)技術(shù)第43頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.DNA結(jié)合染料技術(shù)PCR反應(yīng)體系中加入SYBRGreenI染料，能選擇性地?fù)饺胫岭p鏈DNA分子中，并且產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光PCR過(guò)程中，SYBRGreenI染料結(jié)合到新合成的雙鏈DNA分子中，結(jié)合的熒光信號(hào)和DNA含量成正比二、定量PCR第44頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

二、定量PCR第45頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點(diǎn)：成本較低，無(wú)須對(duì)引物或探針進(jìn)行特殊的熒光標(biāo)記，操作亦比較簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：特異性不夠，染料分子會(huì)結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反應(yīng)體系中的熒光本底較高二、定量PCR第46頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.水解探針技術(shù)技術(shù)熒光素標(biāo)記探針探針的5′端和3′端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)R和熒光淬滅基團(tuán)Q探針完整時(shí)R基團(tuán)與Q基團(tuán)分別位于探針的二端，Q基團(tuán)抑制R基團(tuán)使其不能發(fā)射熒光二、定量PCR第47頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月熒光信號(hào)檢測(cè)PCR過(guò)程中，TaqDNA聚合酶沿模板移動(dòng)，其5′→3′外切核酸酶活性，可逐個(gè)水解脫氧核苷三磷酸，R基團(tuán)與Q基團(tuán)隨之分離R基團(tuán)不再受Q基團(tuán)的抑制便發(fā)射熒光，R基團(tuán)信號(hào)強(qiáng)弱的程度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的拷貝數(shù)成正比二、定量PCR第48頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月水解探針技術(shù)二、定量PCR第49頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、定量PCR第50頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.雜交探針技術(shù)（hybridizationprobe）反應(yīng)體系需要2條探針探針A的3′端標(biāo)以熒光素作為熒光染料供體；探針B的5′端標(biāo)以另一種染料，作為熒光染料受體。2個(gè)探針的序列頭尾排列，并且相距僅間隔1個(gè)堿基，從而能夠進(jìn)行熒光共振能量的轉(zhuǎn)移二、定量PCR第51頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月外來(lái)光源首先刺激供體熒光染料，供體便發(fā)光刺激附近的受體熒光染料，使后者再發(fā)射出具另一種波長(zhǎng)的信號(hào)而被檢測(cè)系統(tǒng)接收受體熒光染料在2個(gè)探針都與模板雜交時(shí)才會(huì)被激發(fā)而發(fā)射熒光信號(hào)二、定量PCR第52頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分子信標(biāo)是一段熒光素標(biāo)記的寡核苷酸環(huán)狀區(qū)(15～30個(gè)核苷酸)柄區(qū)(5～8個(gè)堿基對(duì))組成5′末端標(biāo)記熒光基團(tuán)3′末端標(biāo)記淬滅基團(tuán)4.分子信標(biāo)技術(shù)（molecularbeacon）二、定量PCR第53頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀，兩端的基團(tuán)相距較近，熒光基團(tuán)將能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)而使熒光淬滅，熒光本底極低當(dāng)分子信標(biāo)與序列互補(bǔ)的靶分子結(jié)合時(shí)，分子信標(biāo)的構(gòu)型發(fā)生變化，柄部被打開(kāi)，從而使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)射熒光二、定量PCR第54頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分子信標(biāo)技術(shù)原理R二、定量PCR第55頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月定量PCR參照系統(tǒng)二、定量PCR1.外參照系統(tǒng)的設(shè)置2.內(nèi)參照系統(tǒng)的設(shè)置第56頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.外參照系統(tǒng)Ct值(cyclethreshold)擴(kuò)增曲線與熒光本底基線的交叉點(diǎn)處相應(yīng)的反應(yīng)循環(huán)數(shù),即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值與模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性反比關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小二、定量PCR第57頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖二、定量PCR第58頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)二、定量PCR第59頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.內(nèi)參照系統(tǒng)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品:一段人為地引入了突變序列的靶基因片段內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入被檢樣品中一起抽提、擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因的探針?lè)謩e用2種不同的熒光染料標(biāo)記，二者探針雜交的序列不同二、定量PCR第60頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增靶基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，雙通道熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以特異地同時(shí)檢測(cè)出內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，計(jì)算出靶基因起始拷貝數(shù)內(nèi)參照系統(tǒng)避免了由于不同抽提效率導(dǎo)致的樣本間的差異，使結(jié)果的重復(fù)性更好，定量更為準(zhǔn)確,但仍不能監(jiān)控內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因是否有一致的擴(kuò)增效率二、定量PCR第61頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、多重PCR(multiplexPCR)

在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣本中多個(gè)靶片段第62頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變1.引入點(diǎn)突變ABABP2P1PCR用酶A和B消化，將突變位點(diǎn)引入PCR產(chǎn)物第63頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.引入大片段缺失四、PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變第64頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、連接酶鏈反應(yīng)(LCR）

空隙LCR引物與模板特異性互補(bǔ)引物A和B之間、a和b之間有一段空隙空隙在DNA聚合酶的作用下特異性延伸連接酶連接缺口第65頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)RAPD是一種在整個(gè)基因組DNA內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增而獲得多態(tài)性長(zhǎng)度DNA片段的技術(shù)用一條隨機(jī)序列的引物與模板DNA序列作隨機(jī)配對(duì)，反應(yīng)過(guò)程中隨機(jī)引物只有在與模板DNA互補(bǔ)后，在足夠近的間距(200～2000bp)內(nèi)、方向相對(duì)的兩個(gè)引物片段之間的模板DNA序列才能被擴(kuò)增第66頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA不同個(gè)體DNA序列之間存在差異或發(fā)生突變，經(jīng)擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物片段長(zhǎng)度會(huì)有所不同，經(jīng)過(guò)電泳分離便可以發(fā)現(xiàn)這種差異，從而可了解和比較兩個(gè)生物體之間基因組DNA的結(jié)構(gòu)等信息第67頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA第68頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RAPD的應(yīng)用種群生物學(xué)研究基因組DNA圖譜構(gòu)建遺傳鑒定臨床致病菌的流行病學(xué)檢測(cè)和分型DNA指紋鑒定六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA第69頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)第70頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)一、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）二、等位基因特異性寡核苷酸（ASO）三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）四、變性梯度凝膠電泳（DGGE）五、融點(diǎn)曲線分析(meltingcurveanalysis)六、PCR產(chǎn)物的序列分析（sequencing）第71頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR-RFLP是對(duì)PCR產(chǎn)物作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析根據(jù)PCR產(chǎn)物的突變序列是否位于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)而設(shè)計(jì)突變點(diǎn)在某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)序列時(shí)，可在突變點(diǎn)的二側(cè)設(shè)計(jì)引物，或通過(guò)改變引物序列使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生（或消失）酶切位點(diǎn)第72頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離，PCR產(chǎn)物能（或不能）被酶水解而產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段根據(jù)水解片段的大小和相應(yīng)電泳位置可區(qū)分野生型和突變型靶基因片段一、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性第73頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EcoRI水解

ABCABC一、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性第74頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、等位基因特異性寡核苷酸用寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測(cè)點(diǎn)突變的技術(shù)被檢靶片段經(jīng)PCR擴(kuò)增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與經(jīng)標(biāo)記的野生型和突變型靶基因序列的寡核苷酸探針雜交第75頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針進(jìn)行雜交含突變序列的產(chǎn)物僅與突變探針雜交根據(jù)有無(wú)雜交信號(hào)判斷被檢擴(kuò)增片段中是否帶有突變點(diǎn)二、等位基因特異性寡核苷酸第76頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、等位基因特異性寡核苷酸第77頁(yè)，課件共8