原花青素生物合成途徑及基因的研究進(jìn)展

原花青素生物合成途徑及基因的研究進(jìn)展

原花粉素（pa）也被稱為隨機(jī)單元（ct）。這是一種獨(dú)特且廣泛存在的高等植物。它是以pa、單帶或多酚類化合物的形式存在的。PA對(duì)于植物具有抗紫外線、抗病、抗蟲、清除自由基、調(diào)節(jié)種子休眠和萌發(fā)等生理功能,并影響作物的適口性、可消化性、保健價(jià)值等品質(zhì)性狀。PA提取物具有多方面的醫(yī)療價(jià)值,可用于抗衰老、防治心血管疾病、防治腫瘤等(Dixon等2005)。近年來,隨著對(duì)擬南芥等植物一系列種皮色澤突變體的分子研究的深入,PA的生物合成途徑、主要功能基因、分子調(diào)控機(jī)理等已基本闡明,為通過代謝工程進(jìn)行PA相關(guān)性狀的植物改良奠定了基礎(chǔ)(Xie和Dixon2005;Lepiniec等2006)。1公共苯丙烷途徑如圖1所示,PA的生物合成是由公共苯丙烷途徑、核心類黃酮-花青素途徑、PA特異途徑這3個(gè)連續(xù)的代謝途徑構(gòu)成的一個(gè)復(fù)合途徑完成的。1.1公共苯丙烷途徑公共苯丙烷途徑是指從苯丙氨酸到對(duì)羥基肉桂酸(香豆酸)的合成途徑,共有3個(gè)酶。苯丙氨酸解氨酶(PAL)脫去苯丙氨酸的氨基,使其轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸。肉桂酸-4-羥化酶(C4H)催化反式肉桂酸4位上的羥基化,使其轉(zhuǎn)化為反式-4-香豆酸。4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)催化香豆酸與輔酶A的酯化結(jié)合,使香豆酸得以活化,可用于類黃酮、木質(zhì)素等下游分支途徑進(jìn)一步合成各種次生物質(zhì)(Chapple等1994)。1.2黃酮-花青素的主要方法1.3,3-甲基-3-醇花青素還原酶(ANR)將花青素轉(zhuǎn)化成表兒茶素(2,3-順式黃烷-3-醇),它是一類PA單體。在葡萄、茶葉、苜蓿、紅豆草等植物中,無色花青素還原酶(LAR)可以直接將無色花青素轉(zhuǎn)化成兒茶酚(2,3-反式黃烷-3-醇),但擬南芥缺乏該酶(Dixon等2005)。隨后是轉(zhuǎn)運(yùn)和聚合,雖然具體機(jī)制尚欠明了,但綜合近年來的研究進(jìn)展(Pourcel等2005;Sharma和Dixon2005),我們推測(cè)PA單體可能先與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(擬南芥中為AtGST26/AtGSTF12)結(jié)合并運(yùn)向液泡膜,再由位于液泡膜上的MATE家族蛋白(擬南芥中為AtDTX41)和H+-ATPase(擬南芥中為AHA10)(二者可能聯(lián)合?)將其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中,最后由漆酶(擬南芥中為AtLAC15)等氧化酶類將其縮合成不同聚合度的PA聚合物。2植物原生代動(dòng)力學(xué)功能基因2.1公共苯基丙烯酸酯途徑的結(jié)構(gòu)基因2.1.1pal的組成我們對(duì)NCBIGenBank檢索和同源比對(duì)該基因后發(fā)現(xiàn)(后面的基因同此法),很多種植物的PAL基因已克隆,如擬南芥、歐芹、番茄、煙草、菜豆、豌豆、大豆、苜蓿、馬鈴薯、甘藍(lán)型油菜等。多數(shù)植物中的PAL由一個(gè)小基因家族編碼,如擬南芥中有4個(gè)成員,甘藍(lán)型油菜約有2~5個(gè)基因與擬南芥每個(gè)成員對(duì)應(yīng)(Ni等2008)。PAL一般都有1個(gè)位置保守但長(zhǎng)度變化較大的內(nèi)含子,唯獨(dú)擬南芥的AtPAL3有2個(gè)內(nèi)含子。PAL蛋白一般為700個(gè)左右氨基酸,組成同源四聚體,是苯丙烷途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶。我們搜索SwissModelRepository后發(fā)現(xiàn)(后面的基因同此法),酵母、歐芹等PAL以及動(dòng)物的HAL(組氨酸解氨酶)的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析,也有人提出了反應(yīng)中心和一些活性氨基酸位點(diǎn)。2.1.2亞洲棉棉已有擬南芥、玉米、煙草、高粱、矮牽牛、金魚草、菊花、甘藍(lán)型油菜等50種以上植物的C4H基因被克隆,擬南芥和豌豆只有1個(gè),苜蓿有2個(gè),亞洲棉有2個(gè)以上,綠豆、長(zhǎng)春花等有多個(gè)(方從兵等2005)。C4H一般有2個(gè)內(nèi)含子,位置較保守。C4H構(gòu)成細(xì)胞色素P450氧化酶超家族的CYP73家族,催化反應(yīng)依賴于NADPH和O2,蛋白一般為500個(gè)左右氨基酸,一般認(rèn)為它具有1個(gè)N-端膜錨,具有血紅素結(jié)合域、氧結(jié)合位點(diǎn)、ERR三聯(lián)體等,有多個(gè)底物識(shí)別位點(diǎn)(SRS),蛋白為球狀體,擬南芥等植物的C4H晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析(Chen等2007)。2.1.3植物4cl基因表達(dá)在大多數(shù)維管植物中4CL以基因家族的形式出現(xiàn),不同的同工酶功能各異,擬南芥有4個(gè)4CL基因和11個(gè)4CL-like基因。擬南芥、煙草、楊樹等植物4CL的研究較為深入,紅樹莓、蕓香、黃芩、白樺、葡萄、辣椒、丹參、歐芹、大豆等眾多植物的4CL也被克隆。4CL一般有3~6個(gè)內(nèi)含子,水平同源基因間內(nèi)含子的個(gè)數(shù)和位置存在差異。4CL蛋白中存在2個(gè)保守基序,基序I為SSGTTGLPKGV,基序II為GEICIRG(Kajita等1997)。目前尚無4CL蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析的報(bào)道。2.2黃酮-花青素的核心結(jié)構(gòu)因素2.2.1chs編碼區(qū)已在擬南芥、玉米、矮牽牛、苜蓿、歐芹、金魚草、蝴蝶蘭、大豆等多種植物中被克隆,許多植物存在一個(gè)CHS基因家族,但不同物種CHS的拷貝數(shù)差異較大,擬南芥只有1個(gè)。CHS的編碼區(qū)約1.2kb,科間同源性達(dá)60%以上。除金魚草CHS含有2個(gè)內(nèi)含子外,其余植物的CHS都只有1個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子位置保守但長(zhǎng)度變異大,外顯子2比外顯子1保守;CHS是類黃酮途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶(Sommer和Saedler1986;Wang等2000)。苜蓿等植物的CHS蛋白晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析,蛋白的保守域和活性氨基酸位點(diǎn)研究較為深入。2.2.2核心類黃酮iii類已在很多植物中被克隆,如擬南芥、煙草、矮牽牛、苜蓿、洋蔥、葡萄、草莓等。植物有2類CHI基因,I型為所有植物共同,導(dǎo)向核心類黃酮合成,II型為豆科植物特有并導(dǎo)向異黃酮合成,兩類間差異較大,類型內(nèi)部差異較小(Springob等2003)。CHI一般有2~3個(gè)內(nèi)含子,編碼蛋白有200~250個(gè)氨基酸。CHI蛋白結(jié)構(gòu)研究也較為深入,已有苜蓿、大豆等多種植物的CHI晶體結(jié)構(gòu)得到解析。2.2.3gh基因檢測(cè)自1991年從金魚草克隆以來,已從大麥、蘋果、矮牽牛、紫花苜蓿、玉米、擬南芥、甘藍(lán)型油菜、紫蘇、銀杏等多種植物中克隆。GenBank中,多數(shù)植物中克隆得到1~2條F3H基因,擬南芥只有1條,均具有2個(gè)內(nèi)含子,多數(shù)植物的F3H蛋白為350~380個(gè)氨基酸。F3H屬于非血紅素鐵類型的氧化酶超家族,催化反應(yīng)需要分子O2、Fe2+、2-酮戊二酸和抗壞血酸鹽作為輔因子(Pelletier和Shirley1996)。矮牽牛等植物的F3H蛋白已完成晶體解析,三維結(jié)構(gòu)呈果凍型,反應(yīng)中心位于裂口中,結(jié)合Fe2+、2-酮戊二酸等的活性氨基酸位點(diǎn)已得到確認(rèn)。F3H與同屬于該超家族的FNSI(黃酮合酶I)、FLS(黃酮醇合酶)、F6H(類黃酮6-羥化酶)有一定的同源性。2.2.4dfr與3gh蛋白同源性在擬南芥、矮牽牛、紫蘇、甘藍(lán)型油菜和多種植物中已被克隆,多數(shù)植物中被克隆到1~2條,但葡萄中克隆到4條,擬南芥中只有1條。F3’H一般有1~3個(gè)內(nèi)含子,個(gè)數(shù)和位置欠保守。同C4H、F3’5’H(類黃酮3’,5’-羥化酶)一樣,F3’H也屬于細(xì)胞色素P450超家族,構(gòu)成CYP75B亞家族,并且在基因尤其是蛋白序列上與F3’5’H有較高的同源性,在蛋白的一些保守基序上與C4H有一定的同源性。目前尚無F3’H蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析的報(bào)道,但其富脯氨酸膜錨、氧結(jié)合位點(diǎn)、血紅素結(jié)合位點(diǎn)、ERR三聯(lián)體等P450保守性基序較為明確,并且含有VDVKG、VVVAAS保守基序和F3’H特異性的GGEK基序(Xu等2007)。2.2.5DFR/TT3已在擬南芥、非洲菊、玫瑰、康乃馨、百合、葡萄、大麥等多種植物中被克隆,多數(shù)植物中克隆了1~3條,擬南芥只有1條,但百脈根有5條;多數(shù)具5個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子數(shù)量和位置保守。DFR屬于DFR超家族的脫氫酶,一般有337~446個(gè)氨基酸,不同物種間DFR與NADP結(jié)合位點(diǎn)“VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY”是高度保守的(Johnson等1999)。DFR中存在一個(gè)決定底物特異性的26個(gè)氨基酸的區(qū)域,并已揭示了幾個(gè)對(duì)酶活性非常重要的保守性殘基。葡萄等植物的DFR蛋白晶體結(jié)構(gòu)已得到解析。2.2.6小麥氨基酸的同源性已從擬南芥、桃、蝶豆、洋桔梗、紫蘇、葡萄、馬鈴薯、胡蘿卜、菊科植物、圓葉牽牛、銀杏、煙草、大豆等眾多植物中克隆,多數(shù)植物為1~4條,但小麥有6條。該基因在多數(shù)植物中含有1個(gè)內(nèi)含子,但裸子植物銀杏中有2個(gè)內(nèi)含子,而在單子葉植物普通小麥中沒有內(nèi)含子。擬南芥中該基因編碼356個(gè)氨基酸的蛋白(Abrahams等2003)。同F(xiàn)3H、FLS、ACC氧化酶等一樣,LDOX也屬于非血紅素鐵類型的氧化酶超家族,在部分核苷酸序列尤其是蛋白一些保守性基序上與它們有一定的同源性。擬南芥等植物的LDOX蛋白晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析,大體形狀與F3H相似。2.3原藍(lán)色信號(hào)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)基因2.3.1黃烷型的兒茶酚基因該基因最早在銀葉山螞蝗中基于蛋白純化后克隆得到,編碼382個(gè)氨基酸,與異黃酮還原酶具有同源性,直接還原無色花青素而形成2,3-反式黃烷-3-醇(兒茶酚)(Abrahams等2003)。葡萄、西洋梨、草莓、茶葉、百脈根、苜蓿、蘋果、棉花、菜豆、火炬松、大麥等植物中也克隆了該基因,多數(shù)為1~2條,但百脈根中存在2個(gè)亞家族各2條,LAR一般具4個(gè)內(nèi)含子。LAR廣泛分布于高等植物,是兒茶素類PA特異途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶,但奇怪的是擬南芥沒有LAR。LAR蛋白尚沒有晶體解析的報(bào)道,數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥LAR的三維結(jié)構(gòu)實(shí)為BAN的。2.3.2擬南駁岸型pa產(chǎn)物的合成已從擬南芥、西洋梨、草莓、亞洲棉、柿、葡萄、百脈根、香蕉、菜豆、蘋果、銀杏、茶葉、苜蓿等多種植物中克隆,多數(shù)為1~2條,擬南芥只有1條,百脈根中較多;多數(shù)具5個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子數(shù)量和位置較保守,但草莓中只有4個(gè)內(nèi)含子。擬南芥ANR基因編碼342個(gè)氨基酸,與DFR有較高的相似性,還與CAD(肉桂醇脫氫酶)具有低的同源性,屬于DFR超家族的脫氫酶類,是表兒茶素類PA特異途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶,將花青素還原為2,3-順式黃烷-3-醇(表兒茶酚)(Devic等1999;Lepiniec等2006)。多數(shù)植物同時(shí)具有LAR和ANR,能同時(shí)合成兒茶素和表兒茶素,擬南芥由于缺乏LAR而只能合成表兒茶素。ANR蛋白尚沒有晶體解析的報(bào)道,但基于葡萄DFR的三維結(jié)構(gòu),建立了擬南芥ANR的三維模型。2.3.3垂直同源基因同源性GST在每種植物中均以基因超家族的形式出現(xiàn),如擬南芥中有47個(gè)成員,水平同源基因間在多數(shù)區(qū)段上保守,但功能各異,主要表現(xiàn)在底物特異性和轉(zhuǎn)運(yùn)靶向(液泡、胞外等)不同(Wagner等2002)。擬南芥TT19(AtGSTF12)和AtGSTF11、大豆GST22、柑桔GST(DQ207360.1)、矮牽牛AN9(Y07721)、寬葉菜豆GST(AY099257)、水稻GST(NM_193840)、玉米Bz2等基因組成一個(gè)同源群,但它們的功能卻較難根據(jù)同源性來確定。TT19、AN9與Bz2間雖然同源性并不高,但據(jù)報(bào)道它們均轉(zhuǎn)運(yùn)花青素等類黃酮物質(zhì)并定向液泡。TT19還轉(zhuǎn)運(yùn)PA(Kitamura等2004),介于它們中間的AtGSTF11則被推斷有可能轉(zhuǎn)運(yùn)硫代葡萄糖苷(Hirai等2005)。AN9轉(zhuǎn)化tt19突變體后恢復(fù)了花青素的積累,但種皮中沒有褐色色素的積累(Kitamura等2004),表明垂直同源基因間的功能并不完全對(duì)應(yīng)。尚沒完成TT19、AN9和Bz2等蛋白的晶體解析,但基于GST大家族的高度保守性,可用玉米抗除草劑的GSTIII等的模型為模板預(yù)測(cè)出它們的三維結(jié)構(gòu)。2.3.4與其他attp體的關(guān)系擬南芥MATE(multidrugandtoxiccompoundextrusion)大家族由56個(gè)成員構(gòu)成(AtDTX1~AtDTX56),AtDTX41/TT12與其他AtDTX基因的距離較遠(yuǎn)(Li等2002)。TT12有7個(gè)內(nèi)含子,外顯子編碼507個(gè)氨基酸,蛋白有12個(gè)跨膜域用于與液泡膜結(jié)合,在ATP存在時(shí)該蛋白使液泡膜兩側(cè)產(chǎn)生質(zhì)子梯度,將糖基化的黃烷-3-醇向液泡內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)將質(zhì)子泵出液泡外(Debeaujon等2001;Marinova等2007)。其他植物中尚沒有TT12垂直同源基因的公開報(bào)道,不過,葡萄中一個(gè)推定MATE蛋白(CAO069963)和水稻基因組注解的OsTT12(ABA99853)與TT12具有垂直同源性,尤其是在跨膜域和一些跨膜域間的間隔區(qū)很保守。TT12尚沒有解析三維結(jié)構(gòu),基于其他MATE模板也預(yù)測(cè)不出。2.3.5itedh+-atpaseifficiding基因的擴(kuò)增和完善擬南芥質(zhì)膜H+-ATPase基因家族有11個(gè)成員,相互間有較高的同源性。AHA10(autoinhibitedH+-ATPaseisoform10)基因有20個(gè)內(nèi)含子,外顯子編碼947個(gè)氨基酸,其功能既是種皮中PA聚合又是早期種皮細(xì)胞中液泡發(fā)育所必須的(Baxter等2005)。在GenBank登錄的矮牽牛的PH5應(yīng)當(dāng)是AHA10的垂直同源基因。AHA10尚未建立晶體結(jié)構(gòu),但可基于AHA2預(yù)測(cè)其三維結(jié)構(gòu)。2.3.6不同種類白砂糖的抗氧化能力擬南芥漆酶大家族有17個(gè)成員(LAC1~LAC17),相互間有顯著的同源性。LAC15/TT10基因有5個(gè)內(nèi)含子,外顯子編碼565個(gè)氨基酸,蛋白結(jié)合Cu2+,具雙重功能,氧化種皮中的PA單體和木質(zhì)素單體形成聚合物,據(jù)稱也參與根系伸長(zhǎng);TT10與水稻OsLAC1、漆樹RvLAC2、歐亞槭ApLAC1、亞洲棉GaLAC1等具有較高的同源性,后三者也參與多酚代謝,分別氧化漆酚、木質(zhì)素單體、芥子酸而形成漆、木質(zhì)素聚合物、單內(nèi)酯型二聚物(Pourcel等2005;Liang等2006)。TT10及類似蛋白尚未建立晶體結(jié)構(gòu),但可基于其他二酚氧化酶模板預(yù)測(cè)其基本三維結(jié)構(gòu)。2.4植物原花的積累與調(diào)節(jié)遺傳因素2.4.1wip1基因家族屬于擬南芥鋅指情蛋白超家族的WIP亞家族高度同源的6個(gè)成員之一,有1個(gè)內(nèi)含子,外顯子編碼303個(gè)氨基酸,調(diào)控內(nèi)種皮細(xì)胞發(fā)育和分化,靶基因和調(diào)控機(jī)制不明,可能調(diào)控BAN基因等(Sagasser等2002)。大豆GmWIP1、水稻W(wǎng)IP1等與擬南芥WIP亞家族具有較高的同源性,但尚不清楚具體功能。WIP亞家族缺乏三維結(jié)構(gòu)解析,目前的軟件也預(yù)測(cè)不出。2.4.2與b.hlh蛋白相關(guān)的基因?qū)儆跀M南芥R2R3-MYB超家族133個(gè)成員中的1個(gè),有2個(gè)內(nèi)含子,外顯子編碼258個(gè)氨基酸,蛋白N端具有R2R3-MYBDNA結(jié)合域,特異在發(fā)育種子的內(nèi)種皮中調(diào)控結(jié)構(gòu)基因DFR、LDOX、ANR、TT12等的表達(dá)(Nesi等2001)。所有生物的R2R3-MYB蛋白在MYB域極其保守,但在C-端域又極不保守。TT2等MYB因子需要通過MYB域中的特定基序與bHLH蛋白如TT8互作,并需要WD40蛋白TTG1的參與,才能充分發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。同為十字花科的甘藍(lán)型油菜中有3個(gè)TT2的垂直同源基因(BnTT2-1~BnTT2-3)(Wei等2007)。與TT2相似,葡萄中VvMYBPA1基因在果實(shí)成熟時(shí)特異調(diào)控PA的合成,VvMYB5B基因促進(jìn)發(fā)育果實(shí)中花青素和PA的合成(Bogs等2007;Deluc等2008)。TT2及類似蛋白缺乏晶體解析,但幾乎所有的R2R3-MYB蛋白均可預(yù)測(cè)出R2R3-MYB域的基本三維結(jié)構(gòu)。2.4.3與現(xiàn)實(shí)氨基酸相關(guān)的基因?qū)儆跀M南芥bHLH(MYC)超家族161個(gè)成員中的1個(gè),有6個(gè)內(nèi)含子,外顯子編碼518個(gè)氨基酸,蛋白C端有一個(gè)由51個(gè)氨基酸構(gòu)成的bHLHDNA結(jié)合域。在TTG1的參與下,它既可與MYB因子TT2結(jié)合,調(diào)控種皮色素合成,也可與MYB因子PAP1結(jié)合,調(diào)控多種器官中花青素苷的合成,靶基因?yàn)镈FR和BAN,TT8還可調(diào)控自身的表達(dá)(Nesi等2000;Baudry等2004,2006)。TT8及類似蛋白缺乏晶體解析,目前的軟件也預(yù)測(cè)不出。2.4.4ttg1調(diào)控機(jī)制是擬南芥WD-repeat(WDR)超家族237個(gè)潛在成員中的1個(gè)(vanNocker和Ludwig2003),在3’非翻譯區(qū)有1個(gè)內(nèi)含子,外顯子編碼341個(gè)氨基酸,含有4個(gè)WD40重復(fù)。TTG1調(diào)控多個(gè)發(fā)育和生化途徑,包括根毛、莖葉表皮毛的形成,植株花青素苷、種皮粘液、種皮色素的合成與積累,并且是通過與1個(gè)MYB蛋白和1~2個(gè)bHLH蛋白形成復(fù)合物來完成的,因此TT2和TT8的靶基因都是TTG1的靶基因,TTG1還調(diào)控另一個(gè)調(diào)控因子TTG2的表達(dá),但TTG1對(duì)于靶DNA序列的特異識(shí)別似乎不是必要的(Walker等1999;Baudry等2004;Dixon等2005)。雖然WD40蛋白表現(xiàn)出了跨越生物界的高度保守性,但TTG1及類似蛋白缺乏晶體解析,目前的軟件也預(yù)測(cè)不出三維結(jié)構(gòu)。2.4.5wrky家族是擬南芥WRKY超家族75個(gè)成員中的1個(gè),有4個(gè)內(nèi)含子,外顯子編碼429個(gè)氨基酸,有2個(gè)WRKY保守域,是WRKY家族已知調(diào)控形態(tài)建成的唯一成員。TTG2調(diào)控PA的合成,靶基因尚不確定,可能有ANR;它還調(diào)控表皮毛分化和種皮粘液合成,在調(diào)控根表無毛細(xì)胞的發(fā)育時(shí)可能與其他基因存在冗余,但是獨(dú)立于TTG1和GL2(Johnson等2002)。雖然已有擬南芥其他WRKY成員的蛋白三維模型,但無法預(yù)測(cè)出TTG2的基本三維結(jié)構(gòu)。2.4.6氨基酸anr是擬南芥MADSbox超家族B-sister分支的一個(gè)成員,有6個(gè)內(nèi)含子,外顯子編碼252個(gè)氨基酸,含ARABIDOPSISBSISTER(ABS)MADS結(jié)構(gòu)域,調(diào)控珠被細(xì)胞形狀的發(fā)育,但與胚珠的功能無關(guān),還調(diào)控內(nèi)種皮中PA的合成與積累,靶基因不清楚,初步確定有ANR(Nesi等2002;Dixon等2005)。TT16缺乏晶體解析,目前的軟件也預(yù)測(cè)不出三維結(jié)構(gòu)。2.4.7玉米同pac1、bhlh1的結(jié)構(gòu)因子目前已從玉米、矮牽牛、金魚草、葡萄、非洲菊、擬南芥、蘋果、紫蘇等多種物種中克隆了將代謝途徑引向花青素苷積累的一些調(diào)控因子。WDR因子有矮牽牛的PhAN11、蘋果的MdTTG1、玉米的PAC1、紫蘇的PfWD、圓葉牽牛的InWDR1等;R2R3-MYB因子有擬南芥的PAP1/AtMYB75、PAP2/AtMYB90、AtMYB113、AtMYB114,玉米的C1,矮牽牛的AN2,紫蘇的MYB-P1;bHLH因子有擬南芥的GL3和EGL3,玉米的R/B家族如Lc,矮牽牛的AN1和JAF13,紫蘇的MYC-F3G1和MYC-RP等;它們調(diào)控由CHS至LDOX以及花青素苷特異途徑的一些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),使細(xì)胞中積累花青素苷(Yamazaki等2003;Dixon等2005;Grotewold2006;Gonzalez等2008)。3植物原乳青素合成功能基因的重要共同特征3.1模式植物的基因組織特點(diǎn)和基因型的關(guān)系基因組水平和基因水平的加倍及隨后的歧化是植物分子進(jìn)化的重要方向,許多植物的苯丙烷復(fù)合途徑中的多數(shù)位點(diǎn)是由2個(gè)或更多的基因家族成員所編碼的,家族成員間在總體結(jié)構(gòu)和功能上相似,但往往在轉(zhuǎn)錄表達(dá)的組織特異性、誘導(dǎo)表達(dá)特性、蛋白活性水平、蛋白底物/順式元件的偏好性上存在差異。但模式植物擬南芥是小基因組高等植物,其PA途徑中單基因位點(diǎn)相對(duì)較多。擬南芥中公共苯丙烷途徑的3個(gè)酶有2個(gè)是由基因家族編碼的,PAL由4個(gè)成員編碼,C4H為單基因編碼,4CL由4個(gè)成員編碼,但還存在11個(gè)不具有4CL底物特性的4CL-like蛋白。擬南芥類黃酮-PA途徑中,所有結(jié)構(gòu)蛋白(CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、LDOX、ANR、TT19、TT12、AHA10、TT10)及調(diào)控蛋白TT1、TT2、TT8、TT16、TTG1、TTG2均由單基因編碼(Nesi等2001)。但是,象甘藍(lán)型油菜這樣的多倍體物種,很難有單基因位點(diǎn)。本課題組近幾年的系統(tǒng)研究結(jié)果表明,甘藍(lán)型油菜中最少有2個(gè)、最多有12個(gè)以上的垂直同源基因與擬南芥苯丙烷-類黃酮-原花青素途徑的單個(gè)基因相對(duì)應(yīng)(Chen等2007;Wei等2007;Xu等2007;Ni等2008)。3.2黃酮-花青素苷途徑的基因表達(dá)植物界中,PAL、C4H、4CL等公共苯丙烷途徑的基因具有類似組成型表達(dá)的特征,組織特異性不強(qiáng),因?yàn)樗鼈兩婕岸喾N組織中近似組成型的木質(zhì)素的合成與積累,但仍以木質(zhì)素、類黃酮等物質(zhì)密集合成的組織中表達(dá)較豐。類黃酮途徑的基因表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育階段性。植物的花、衰老葉片、花青素苷著色的莖葉表皮中類黃酮-花青素苷途徑的基因大量表達(dá),其他組織中表達(dá)低。開花授精后,內(nèi)種皮中苯丙烷-類黃酮-花青素-原花青素復(fù)合途徑的基因表達(dá)強(qiáng)烈,合成PA,并隨著種皮的發(fā)育而轉(zhuǎn)運(yùn)到其他種皮細(xì)胞層中積累并聚合,而使種皮顯黑褐色(野生型擬南芥為深褐色種皮)。PA合成的全套基因在植物的非種皮組織如柿子果肉、櫟樹種子胚、茶等植物的葉中也表達(dá),合成并積累聚合度較低或呈單體狀的PA。需要指出的是,擬南芥PA特異途徑的一些基因如ANR、TT12、AHA10、TT10、TT1、TT2、TT16等主要在內(nèi)珠被/內(nèi)種皮中表達(dá)。此外,已有研究一致表明,苯丙烷-類黃酮途徑的眾多結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因均具有誘導(dǎo)表達(dá)特性,最典型的是受紫外線誘導(dǎo)而啟動(dòng)/上調(diào)表達(dá),還可以受病原菌侵染、動(dòng)物取食、干旱、溫度脅迫、鹽害等多種生物/非生物性逆境脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)(Sharma和Dixon2005;Lepiniec等2006)。3.3分子抑制劑的結(jié)構(gòu)變化植物細(xì)胞蛋白純化、表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位、蛋白互作研究、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)等表明,苯丙烷-類黃酮-原花青素途徑起催化反應(yīng)的眾多關(guān)鍵酶(從PAL直至ANR)是定位于細(xì)胞漿中的,并且相互之間以一種酶復(fù)合物的形式存在,其中P450蛋白C4H、F3’H等的跨膜域與膜系統(tǒng)(微粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、質(zhì)膜?)結(jié)合而形成復(fù)合物的膜錨,蛋白的其余部位和其他蛋白位于胞漿中(Hrazdina和Wagner1985;Xu等2007)。通過酶復(fù)合物的形成,一是加速了代謝途徑的物質(zhì)流和連續(xù)催化反應(yīng)的效率,二是可能將家族蛋白中的特定成員分工后定向了特定的代謝途徑,進(jìn)行專一化的進(jìn)化。但是,這方面還只是停留在現(xiàn)象觀察和假說階段,詳細(xì)機(jī)制有待闡明?；ㄇ嗨?原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中,預(yù)測(cè)TT19和其他GST一樣定位于胞漿,通過結(jié)合到靶分子而進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn);TT12和AHA10定位于液泡膜,通過產(chǎn)生跨膜質(zhì)子梯度而將靶分子運(yùn)到液泡,但是它們是否與其他蛋白形成復(fù)合轉(zhuǎn)運(yùn)體尚缺乏明確報(bào)道。苯丙烷-類黃酮-原花青素途徑的主要調(diào)控蛋白如TT1、TT2、TT8、TT16、TTG2等均定位于細(xì)胞核,符合轉(zhuǎn)錄因子的特征,雖然TTG1缺乏核定位信號(hào),但據(jù)認(rèn)為它在胞質(zhì)中以與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物的形式而被運(yùn)向細(xì)胞核中。而且,多種調(diào)控蛋白往往是以一個(gè)復(fù)合物的形式與靶基因啟動(dòng)子的順式元件相作用的,最著名的為WD40-MYB-bHLH模型,WD40起支架和平臺(tái)作用,促進(jìn)MYB與bHLH間的分子作用以及其他蛋白互作。擬南芥中,這種復(fù)合物在PA途徑中為TTG1-TT2-TT8,在花青素苷途徑中為TTG1-PAP-TT8,在種皮粘液合成、表皮毛發(fā)育、根毛發(fā)育中則由其他MYB和bHLH因子來取代(Lepiniec等2006;Gonzalez等2008)。3.4類黃酮-pa的突變從酶催反應(yīng)鏈和物質(zhì)流的角度，目前所描繪的苯丙烷-類黃酮-原花青素代謝途徑類似于一條水渠,其上串聯(lián)性地設(shè)立了十幾個(gè)閘口(圖1),每個(gè)酶相當(dāng)于一個(gè)閘口,任意一個(gè)閘口的關(guān)閉即任意一個(gè)酶的去功能化均可導(dǎo)致整個(gè)代謝途徑的阻塞,PA積累受阻。對(duì)于由基因家族編碼同一或相似功能的蛋白而言,基因成員間具有冗余性,單基因突變的表型效應(yīng)有限。而對(duì)于單基因位點(diǎn),突變可能帶來顯著的表型變化?；蛲蛔兊倪z傳和表型效應(yīng)依具體位點(diǎn)而異,不同植物間由于基因冗余性不同而存在差異。由于植物公共苯丙烷途徑一般具有基因家族冗余性,所以尚未見PAL、C4H和4CL單基因突變引起巨大表型變化的報(bào)道。奇怪的是,雖然擬南芥只有1個(gè)C4H基因,但c4h突變體基本能正常生長(zhǎng)發(fā)育,而且能正常積累種皮色素,這說明要么擬南芥中存在另外一種酶可部分代替C4H的活性,要么存在C4H的低效性繞過途徑,這是苯丙烷途徑中值得深入研究的重要現(xiàn)象。類黃酮途徑的基因變異容易引起種皮、花、莖葉表面等器官著色方式的改變,擬南芥、玉米、矮牽牛、金魚草等植物中的研究較系統(tǒng)。擬南芥中由于類黃酮-PA途徑中的所有位點(diǎn)均是單基因,所以這些位點(diǎn)的單基因的功能失活性突變均能產(chǎn)生透明種皮(transparenttesta,tt)和透明種皮無毛(transparenttestaglabra,ttg)突變體(Shirley等1995)。擬南芥核心類黃酮-花青素途徑的關(guān)鍵酶基因CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR和LDOX突變失活后花青素合成之前的步驟受到阻礙,產(chǎn)生黃籽、灰黃籽和黃褐籽等,分別命名為tt4、tt5、tt6、tt7、tt3和tt18/tds4/tt11位點(diǎn)。擬南芥PA特異途徑中,ANR基因突變使種皮中積累花青素而非PA,所以種皮顯紅色,又稱之為ban突變體;GSTF12、DTX41、AHA10和LAC15基因突變后要么PA轉(zhuǎn)運(yùn)受阻,要么PA聚合受阻,產(chǎn)生黃褐籽或褐化推遲,分別命名為tt19/tt14、tt12、aha10和tt10突變體。PA途徑的調(diào)控基因也是一些特定的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)所必須的,擬南芥PA途徑所有已知6個(gè)調(diào)控基因的突變體tt1、tt2、tt8、tt16、ttg1和ttg2均使種皮色素積累受阻而表現(xiàn)為黃籽或黃褐籽,ttg1和ttg2的表皮毛和根毛發(fā)育以及種皮粘液積累受阻。PA途徑的突變體除影響種皮著色外,還影響植物其他性狀。葉片、未成熟果實(shí)、種子中的澀味物質(zhì)為PA及其低聚物,如果柿樹突變體中PA途徑基因表達(dá)受阻,未成熟柿子中的澀味物質(zhì)較少或沒有(Lepiniec等2006)。4植物原花素系統(tǒng)的進(jìn)展與展望4.1提高pa的含量PA對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的影響受到關(guān)注。對(duì)于單胃動(dòng)物,食料中的PA總是有害的(Aerts等1999)。對(duì)于反芻動(dòng)物,高濃度PA會(huì)降低草料的適口性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(Mueller-Harvey和McAllan1992),但適當(dāng)濃度的PA與蛋白的結(jié)合物可適當(dāng)抑制瘤胃中的微生物,增加過瘤蛋白并使之成為動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Aerts等1999)。紫花苜蓿是最主要的牧草,雖在種皮中積累PA,但在葉中不積累PA,導(dǎo)致含蛋白質(zhì)很高的牧草在瘤胃中過快地被微生物所消化,產(chǎn)生大量溫室氣體甲烷,動(dòng)物容易得脹氣病而死。牧草中適量的PA可以控制蛋白質(zhì)的消化進(jìn)程,增加飼料利用率,消除動(dòng)物的脹氣病。在不增加羊自由采食量的前提下,百脈根中2%~4%的PA能提高羊毛生長(zhǎng)速度1%、體重8%、產(chǎn)奶量21%和產(chǎn)羔率15%~30%。將PA生物合成的功能基因?qū)氲阶匣ㄜ俎：腿~草等牧草中,提高PA含量,是一個(gè)不錯(cuò)的技術(shù)路線(Dixon等2005,2006)。將玉米B-Peru和C1基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿后,葉組織中有PA積累(Ray等2003)。隨著對(duì)PA生物合成途徑的深入了解,今后需要制定更加合理的分子育種路線,一方面消除單胃動(dòng)物飼料中的PA,另一方面使反芻動(dòng)物飼料中維持合理的PA水平。4.2制備工藝過程中pa的基因表達(dá)高粱是釀造白酒的上乘原料,但高含量的PA會(huì)在發(fā)酵中與α-淀粉酶和蛋白酶結(jié)合,使酶的相變溫和熱熔發(fā)生變化,活性降低,影響釀造(劉睿等2006)。柿子是人們鐘愛的水果之一但柿果中的PA產(chǎn)生強(qiáng)烈的澀味和收斂作用,影響取食口感、消化特性甚至人的胃腸功能,因此脫澀是柿子利用的一個(gè)重要內(nèi)容。全甜柿類型(PCNA隨著果實(shí)的成熟而失去澀味,而完全澀柿類型(PCA即使是在果實(shí)成熟后仍保留澀味。在果實(shí)發(fā)育的早期,兩種類型都帶有澀味,PA合成的9個(gè)結(jié)構(gòu)基因都高水平地表達(dá)。后來的果實(shí)發(fā)育中,PCNA柿子中PA合成的有關(guān)基因停止表達(dá),PA積累突然終止,但PCA柿子直到成熟時(shí)這9個(gè)基因同樣高水平表達(dá),PA繼續(xù)積累(Ikegami等2005)。柿子中ANR、類絲氨酸羧肽酶(SCPL)等基因已經(jīng)克隆,未成熟柿子經(jīng)乙醇處理不僅能直接使PA變成不可溶的物質(zhì),還導(dǎo)致PA合成途徑中基因表達(dá)水平的下調(diào)(Ikegami等2007)。以上只是2個(gè)典型例子,其實(shí)許多農(nóng)產(chǎn)品都涉及到如何消除食用器官中的澀味的問題。通過傳統(tǒng)手段選育不含或低含PA的高粱、柿子并不容易,因?yàn)槭紫缺仨殑?chuàng)造PA積累相關(guān)基因突變或表達(dá)下調(diào)的基因型。隨著對(duì)PA生物合成途徑的深入解析,完全可以采用代謝工程手段對(duì)PA途徑的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因進(jìn)行多價(jià)沉默,抑制PA積累,創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因無澀味農(nóng)產(chǎn)品。4.3黃籽品種的遺傳穩(wěn)定性研究與黑籽油菜相比，黃籽油菜的種皮薄,含油量高,油質(zhì)清澈透明,餅粕蛋白質(zhì)含量高,纖維素和多酚含量低,飼料利用價(jià)值高,因此國(guó)內(nèi)外都把黃籽作為油菜育種的一個(gè)重要目標(biāo)。種皮柵狀細(xì)胞層中的色素主要為PA聚合物,黃籽是因?yàn)榉N皮色素減少、種皮透明而觀察到種胚的顏色(Tang等1997)。天然的甘藍(lán)型油菜中缺少黃籽基因型,現(xiàn)有的甘藍(lán)型油菜黃籽類型主要通過種間遠(yuǎn)緣雜交而產(chǎn)生,育種周期長(zhǎng),且黃籽表現(xiàn)型不穩(wěn)定,易隨環(huán)境而變異,選育效率低(劉后利1992)。運(yùn)用代謝工程的方法,抑制與PA積累相關(guān)基因的表達(dá),是創(chuàng)造油菜穩(wěn)定黃籽性狀的一個(gè)重要策略。比如,擬南芥TT2、PAP等轉(zhuǎn)錄因子的基因工程操作成功地通過調(diào)節(jié)BAN等基因的表達(dá)而達(dá)到了修飾PA積累效果(Sharma和Dixon2005)。近5年來,本課題組對(duì)甘藍(lán)型油菜及其親本物種甘藍(lán)和白菜型中苯丙烷-類黃酮-原花青素途徑的主要結(jié)構(gòu)基因家族和調(diào)控基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)的克隆,主要基因均獲得了全長(zhǎng)cDNA和對(duì)應(yīng)的基因組序列,通過蕓薹屬內(nèi)種間以及蕓薹屬與擬南芥屬間功能比較基因組學(xué)的研究,揭示了諸多物種進(jìn)化、基因進(jìn)化、表達(dá)調(diào)控的規(guī)律,對(duì)甘藍(lán)型油菜黑籽優(yōu)良品種中多個(gè)功能位點(diǎn)進(jìn)行反義沉默后,獲得了一批種皮色素變淺的轉(zhuǎn)基因株系。4.4葡萄品質(zhì)的改良葡萄籽和葡萄皮中含有較多的PA,葡萄和葡萄酒中的PA對(duì)健康有積極作用,如抗氧化、清除自由基、保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗突變、抗炎等,也是影響葡萄酒風(fēng)味和品質(zhì)的重要成分(趙艷和吳坤2006)。針對(duì)鮮食和不同的釀造目的,葡萄中的總酚、PA和花青素苷需要合理的含量,過高和過低均不好,而現(xiàn)有資源間的差異較大(李記明和賀普超2000),因此葡萄品質(zhì)改良中涉及PA等類黃酮物質(zhì)的優(yōu)化。此外,葡萄籽是人工提取用于醫(yī)療和保健業(yè)的PA的最重要原料,如何在保證葡萄和葡萄酒品質(zhì)的前提下,使葡萄籽的PA含量盡可能高(如高PA種仁),值得探索。已從葡萄中克隆了LAR和ANR,現(xiàn)在葡萄PA合成的許多基因都已克隆,運(yùn)用代謝工程調(diào)控葡萄籽和葡萄皮中PA的水平已成為可能(Bogs等2005)。