藥物分析 第十五章甾體激素類藥物的分析

1第十五章甾體激素類藥物的分析學(xué)習(xí)要求1.掌握甾體激素類藥物的分類，結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)及其之間的關(guān)系2.熟悉甾體激素類藥物的有關(guān)物質(zhì)與檢查方法3.了解甾體激素類藥物的體內(nèi)藥物分析與應(yīng)用2環(huán)戊烷并多氫菲ABCD12345678910111213141516171819甾第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與分類3分類：甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素雄激素及蛋白同化激素孕激素雌激素4

腎上腺皮質(zhì)激素氫化可的松⊿4-3-酮基部分藥物6,7C為雙鍵α-醇酮基21C5腎上腺皮質(zhì)激素地塞米松磷酸鈉⊿4-3-酮基α-酮基酯磷酸鈉6一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.腎上腺皮質(zhì)激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)

C17–α–醇酮基還原性7雄性激素甲睪酮C17醇羥基⊿4-3-酮基19C8雄性激素丙酸睪酮9蛋白同化激素苯丙酸諾龍10位C無角甲基苯丙酸酯102.雄性激素及蛋白同化激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)

C17–β–羥基可成酯11孕激素黃體酮甲酮基21C12孕激素醋酸甲地孕酮17位甲酮基13炔諾酮口服避孕藥14炔諾孕酮口服避孕藥153.孕激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)C17–甲酮基與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)16雌性激素炔雌醇A環(huán)為苯環(huán)，C3位有酚羥基18C17雌性激素雌二醇A環(huán)為苯環(huán)，C3位有酚羥基184.雌性激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)A環(huán)為3–OH苯環(huán)UV、與重氮苯磺酸鹽反應(yīng)C17–乙炔基與AgNO3反應(yīng)C17–羥基可成酯19甾體激素C數(shù)A環(huán)17位取代基腎上腺皮質(zhì)激素21△4–3–酮α-醇酮基雄性激素19△4–3–酮β-OH孕激素21△4–3–酮甲酮基雌激素18苯環(huán)、C3-酚OHβ-OH；α-C≡C甾體激素類藥物的分類與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)20結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系***主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–

酮UV、與羰基試劑反應(yīng)

C17

–

α–

醇酮基還原性C17–OH可成酯C17–甲酮基與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)A環(huán)為3–OH苯環(huán)UVC17–C≡C與AgNO3反應(yīng)？？？？？？21第二節(jié)理化性質(zhì)與鑒別試驗(yàn)一、性狀1.溶解度:白色至微黃色粉末或結(jié)晶性粉末2.熔點(diǎn)：測定熔點(diǎn)能夠反映藥物純度3.比旋度：手性碳原子，旋光性4.吸收系數(shù)：具有紫外吸收22二、化學(xué)鑒別法（一）與強(qiáng)酸的顯色反應(yīng)甾體激素類藥物呈色H2SO4

、H3PO4HClO4、HCl（母核）酮基先質(zhì)子化，形成C+離子23與硫酸顯色反應(yīng)

顯色熒光加水稀釋潑尼松龍深紅

絮狀灰↓潑尼松橙

黃→藍(lán)綠炔雌醚橙紅

黃綠紅色↓炔雌醇橙紅

黃綠

絮狀玫紅↓醋酸可的松黃或微褪色并澄清

帶橙24(二)官能團(tuán)的反應(yīng)腎上腺皮質(zhì)激素藥物呈色四氮唑鹽OHˉ1、C17

-α-醇酮基還原性其他：斐林試液、多倫試液四氮唑比色法25甾酮類激素藥物呈色羰基試劑2.酮基和C20–酮基*常用的羰基試劑：2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼26具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物呈色亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚、芳香醛3.C17-甲酮基Na2Fe(CN)5NO27黃體酮藍(lán)紫色亞硝基鐵氰化鈉其他甾體淡橙色/不顯色28雌激素類紅色偶氮染料重氮苯磺酸4.酚羥基29含炔基的甾體激素白↓硝酸銀5.乙炔基的沉淀反應(yīng)↓30有機(jī)氟Fˉ有機(jī)破壞有機(jī)氯Clˉ6.鹵素茜素氟藍(lán)

硝酸亞鈰硝酸-硝酸銀AgCl↓

呈色

316.酯的反應(yīng)醋酸酯醋酸水解乙酸乙酯H2SO4乙醇香氣戊酸酯己酸酯水解酸化戊酸己酸特臭32△４-3-酮、苯環(huán)、其他共軛結(jié)構(gòu)三、UV法1.結(jié)構(gòu)依據(jù)240nm左右280nm左右332.例曲安西龍丙酸倍氯米松

溶劑甲醇乙醇20μg/ml濃度20μg/ml結(jié)果判斷在238nm處有最大吸收在239nm處有最大吸收，A為0.57～0.60，在239nm與263nm處的吸收度比值為2.25～2.4534結(jié)構(gòu)特征：酚羥基、苯環(huán)C17–OH、C17–乙炔基例：炔雌醇四、IR351505cm-1ν3505cm-13300cm-1ν1590cm-13610cm-1ν酚羥基醇羥基1615cm-1苯環(huán)的骨架振動(dòng)炔雌醇的IR圖譜36五、色譜法主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別1.TLC：對(duì)照品法要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同。37丙酸睪酮注射液：硅膠GF254板，254nm紫外燈下復(fù)方炔諾酮片：硅膠G板，顯色劑?

?前沿12供試品對(duì)照品382.HPLC方法：對(duì)照品法要求在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品峰的tR與對(duì)照品峰的tR一致。39對(duì)照品供試品醋酸曲安奈德的鑒別40第三節(jié)特殊雜質(zhì)與檢查一、有關(guān)物質(zhì)的檢查有關(guān)物質(zhì)：主要是藥物中存在的合成的起始物、中間體、副產(chǎn)物以及降解產(chǎn)物等檢查意義：與甾體激素藥物結(jié)構(gòu)相似，也有一定的藥理作用而又互不相同檢查方法：具有一定分離能力——TLC、HPLC41（一）TLC——多為自身稀釋對(duì)照法判定方法：

規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目

、斑點(diǎn)顏色1.高濃度樣品(供試液)2.低濃度樣品(對(duì)照液)

1

2

.

.42例：氫化可的松中其他甾體的檢查供試液：本品+氯仿-甲醇（9：1）濃度：3.0mg/ml對(duì)照液：供試液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1）濃度：60μg/ml層析：供試液

對(duì)照液判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，不得多于3個(gè)，其顏色與對(duì)照液的主斑點(diǎn)比較，不得更深。點(diǎn)樣、展開、干燥、顯色堿性四氮唑藍(lán)43（二）HPLC——主成分自身對(duì)照法判定方法：

規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目、峰面積供試液：高濃度樣品對(duì)照液：低濃度樣品以對(duì)照液主峰的面積作為參比例.甲睪酮中有關(guān)物質(zhì)的檢查供試品溶液顯示的雜質(zhì)峰數(shù)不得超過3個(gè)，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照液主峰面積的0.5倍44來源：合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫劇毒方法：藥物氧瓶燃燒二氨基萘比色法測定二、硒的檢查45三、殘留溶劑的檢查甲醇

L=0.3%丙酮

L=0.5%

內(nèi)標(biāo)法+校正因子例：地塞米松磷酸鈉中殘留溶劑的檢查——GC殘留溶劑：在原料藥或輔料的生產(chǎn)過程中，以及在制劑制備過程中使用的，但在工藝過程中未完全除去的有機(jī)溶劑46四、游離磷酸鹽的檢查地塞米松磷酸鈉——對(duì)照品比色法方法：供試液+鉬酸銨→磷鉬酸銨1-氨基-2-萘酚-4-磺酸還原磷鉬酸藍(lán)：740nm對(duì)照液：同上要求：供試品溶液的A不得大于對(duì)照溶液的A47對(duì)照液：0.035mg/ml的KH2PO44.0mlL的計(jì)算？48多采用RP－HPLC（內(nèi)標(biāo)法）避免其他甾體的干擾第四節(jié)含量測定測定對(duì)象：甾體激素類藥物的原料和制劑一、HPLC特點(diǎn)：用樣量少，靈敏度高，分離效果好，測定速度快常用49二、UV△４-3-酮

240nm（±）腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素、口服避孕藥苯環(huán)

280nm（±）雌激素適用：炔雌醚、炔孕酮、醋酸潑尼松龍片、氫化可的松片少用50例：醋酸潑尼松龍片的含量測定研成細(xì)粉取W100ml過濾5ml100ml測A24320片→推導(dǎo)其含量計(jì)算公式51標(biāo)示％＝利用對(duì)照品比較法，公式？521.適用于弱/非分光光度活性藥物2.使待測組分光譜位移，避免干擾3.增加測定靈敏度4.增加選擇性弱/非分光光度活性藥物強(qiáng)分光光度活性藥物顯色劑三、比色法53對(duì)照品比較法測定試劑空白：用同體積的溶劑代替供試液和對(duì)照液，然后依次加入等量的試劑，并用同法處理54腎上腺皮質(zhì)激素類C17-α－醇酮基具強(qiáng)還原性，可在強(qiáng)堿性條件下將四氮唑鹽還原為有色甲1.原理（一）四氮唑比色法有色甲四氮唑鹽醇酮基-a-17COH-[還原]月朁月朁552.四氮唑鹽種類氯化三苯四氮唑（TTC）/紅四氮唑（RT）三苯甲↓深紅[H]月朁56藍(lán)四氮唑（BT）[H]雙甲暗藍(lán)色，525nm月朁573.方法：25℃氫氧化四甲基銨對(duì)照液供試液A485TTC40～45′暗例：醋酸地塞米松磷酸鈉注射液——對(duì)照品比較法58(1)溶劑、水分的影響

含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10%含水30%→幾無反應(yīng)醛？無水乙醇→A↑無醛無水乙醇水？4.討論59（2）堿的種類及加入順序以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳，pH＞13.75加入順序：堿試液四氮唑鹽皮質(zhì)激素溶液60(3)O2與光線的影響反應(yīng)過程反應(yīng)產(chǎn)物怕光→避光、快速O2影響顏色強(qiáng)度和穩(wěn)定性→隔絕空氣、快速、充N261（4）溫度與時(shí)間ChP25℃反應(yīng)40～45minBP30℃1h62(5)基團(tuán)對(duì)反應(yīng)速度的影響C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯635.特點(diǎn)缺點(diǎn)：影響因素太多優(yōu)點(diǎn)：測定結(jié)果能反映藥品的穩(wěn)定性（氧化及降解產(chǎn)物無此反應(yīng)）少用適用：醋酸地塞米松磷酸鈉注射液64腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素適用：C3－酮基1.原理異煙腙（黃）C3-酮基異煙肼HCl（縮合）420nm（二）異煙肼比色法65異煙腙（黃色）++H2O662.方法60℃異煙肼測A42060′對(duì)照液供試液供試品對(duì)照品甲醇例：倍他米松磷酸鈉——對(duì)照品比較法2010年版-HPLC67（1）溶劑的選擇異煙肼鹽酸鹽在甲醇和乙醇中的溶解度大無水甲醇（試劑穩(wěn)定性好，呈色強(qiáng)度高）無水乙醇（對(duì)植物油溶解度大）3.討論68（2）酸的種類和濃度酸:異煙肼=2:1最大A常用：鹽酸69（3）水分、溫度、O2與光線的影響含水量↑→O2與光線對(duì)反應(yīng)的影響不大t℃↑→ν↑腙水解↑→A↓→%↓70（4）反應(yīng)專屬性C3=O＞C20=OC11=O不反應(yīng)C3－酮基適用：影響因素多，已被HPLC取代711.原理λmax=465λmax=515（三）柯柏（Kober）反應(yīng)比色法△△桃紅黃色雌激素H2SO4-乙醇H2O/稀H2SO472雌二醇-3-甲醚λmax=465λmax=515++73465450500550nmAKober反應(yīng)吸收光譜第一步反應(yīng)515第二步反應(yīng)742.特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：較高的靈敏度具有一定的選擇性缺點(diǎn)：非化學(xué)計(jì)量反應(yīng)反應(yīng)控制條件注意平行原則適用：低劑量雌激素制劑如：復(fù)方炔諾孕酮滴丸中炔雌醇的含量測定75鐵－酚試劑[(NH4)2Fe(SO4)2+H2SO4+H2O2+苯酚]*鐵鹽的作用

加速呈色反應(yīng)的速率、提高穩(wěn)定性*酚的作用

加快紅色產(chǎn)物的形成消除反應(yīng)產(chǎn)生的熒光76第五節(jié)體內(nèi)甾體激素類藥物分析方法：GC-MSHPLC-MS樣品：尿樣、血樣前處理：固相微萃取77固相微萃?。⊿olid-phasemicroextraction,SPME)具有選擇吸附性的涂層萃取濃縮解吸78

在線SPME→LC-MS——反興奮劑檢測的有力工具SPME特點(diǎn)：不使用有機(jī)溶劑萃取時(shí)間短＜30min樣品用量少79練習(xí)與思考[A型題]1.醋酸地塞米松的鑒別方法是A.三氯化鐵反應(yīng)B.水解反應(yīng)C.柯柏反應(yīng)D.與堿性酒石酸銅試液反應(yīng)E.雙縮脲反應(yīng)2.丙酸睪酮《中國藥典》規(guī)定的含量測定方法為A.非水溶液滴定法B.溴酸鉀法C.HPLC法D.紫外分光法E.旋光法803.用四氮唑比色法測定皮質(zhì)激素類藥物，是利用C17

–α醇酮基的何種性質(zhì)？

A．氧化性

B．還原性

C．可加成性

D．酸性

E．堿性814.用異煙肼比色法測定甾體激素藥物含量時(shí)，其溶液的環(huán)境是

A．強(qiáng)酸性

B．中性

C．強(qiáng)堿性

D．弱堿性

E．以上都不對(duì)825.能與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)生成藍(lán)紫色的藥物是

A．雌二醇

B．黃體酮

C．醋酸可的松

D．苯丙酸諾龍

E．以上都不對(duì)836.各國藥典對(duì)甾體激素類藥物常用HPLC或GC法測定其含量，主要原因是：它們沒有特征紫外吸收不能用滴定分析法進(jìn)行測定C.由于其它甾體的存在，色譜法可消除它們的干擾D.色譜法比較簡單，精密度好E.色譜法準(zhǔn)確度優(yōu)于滴定分析法847.異煙肼比色法測定甾體激素類藥物時(shí)，藥物的呈色基團(tuán)是：

A.酮基

B.酚羥基

C.活潑亞甲基

D.炔基

E.甾體母核858.Kober反應(yīng)適用于哪一藥物的含量測定

A.黃體酮

B.雌二醇

C.