富硒靈芝調(diào)控大鼠乙酰輔酶A羧化酶α表達治療非酒精性脂肪肝病的研究

富硒靈芝調(diào)控大鼠乙酰輔酶A羧化酶α表達治療非酒精性脂肪肝病的研究

武俊紫，賈亞敏，沈平瑞，胡躍高，全勝麟，李燕*，李樹德1昆明理工大學昆華醫(yī)學院，昆明650504;2云南省第一人民醫(yī)院干部保健科，昆明650031;3太原理工大學現(xiàn)代科技學院，太原030021;4沈陽康硒生物工程研究所，沈陽110015;5中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，北京100094;6昆明醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，昆明650504硒(Selenium，Se)是人體必需的微量元素之一［1］，其在肝臟內(nèi)是構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶(GlutathionePeroxidase，GSH-Px)的重要成分之一。人體內(nèi)硒的主要來源為食物，但富硒食品相對較少。靈芝(Ganoderma)是藥食兩用菌，屬于珍貴的藥用真菌之一，具有養(yǎng)心安神、補氣益血、補肺平喘、滋補強壯、扶正固本等功效，同時靈芝對某些微量元素特別是硒具有高度的富集作用，可以將水中添加無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，利于人體攝入［2］。本實驗采用富硒靈芝治療非酒精性脂肪肝病(Non-AlcoholicFattyLiverDisease，NAFLD)大鼠，現(xiàn)對治療前后大鼠SREBF1、ACCα及其相關因子做統(tǒng)計分析。1材料與方法1.1材料1.1.1動物60只雄性清潔級SD大鼠［合格證號:SYXK(滇)2011-0004］，體重160～180g，動物、基礎飼料以及飼養(yǎng)用墊料均由昆明醫(yī)科大學動物實驗部提供。1.1.2高脂溶液配制與灌胃量97%豬油、2%膽固醇與1%膽酸鈉配置100%高脂溶液，大鼠灌胃時采用16mm灌胃針頭，大鼠灌胃量為每100g大鼠體重灌1mL高脂溶液，每天早上灌胃一次，另模型對照組和富硒靈芝治療組在造模全程內(nèi)日常飲水均為10%的紅糖水。1.1.3藥品與試劑富硒靈芝(含硒量為3.162mg/kg)，由沈陽康硒生物工程研究所提供。膽固醇購自北京鼎國生物技術(shù)公司，膽酸鈉購自上海金穗生物公司，豬油和紅糖市場自購;血糖、GSH、MDA、SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所;ALT、AKP、r-GT、胰島素以及AST等相關ELISA試劑盒購自Bio-Swamp公司，LDH試劑盒購自上海谷研實業(yè)有限公司，鼠抗兔多克隆抗體SERBF-1、ACCα和ECL發(fā)光試劑盒購自美國SantaCruz公司，相應二抗購于中杉金橋公司。1.2方法1.2.1非酒精性脂肪肝模型的建立及給藥方法60只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、富硒靈芝組，造模成功后富硒靈芝組每只大鼠每次給予富硒靈芝水5mL(1g富硒靈芝+10mL水煮沸0.5h，冷卻過夜浸泡)，每天灌胃二次，模型對照組給予相應生理鹽水灌胃參照，空白對照組則不加以任何干涉，分別與6周和12周處死大鼠各半，測定其相應指標。1.2.2標本的采集用3%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后無菌操作暴露腹腔，10mL注射器心臟迅速取血;血液離心，取上清液，-86℃保存;肝臟稱取100mg用于勻漿提取上清液，其余-86℃保存。1.2.3病理學檢查方法取肝左葉，10%中性福爾馬林溶液固定，肝臟組織酒精脫水，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學改變，并采取不同視野，每個切片照四張像。1.2.4相關指標檢測方法GSH以及血糖的測定方法為酶法，MDA測定方法為TBA法，SOD的測定方法為WST-1法，LDH、ALT、AKP、r-GT、胰島素以及AST測試方法為雙抗體夾心法。1.2.5RT-PCR檢測SERBP-1、ACCαmRNA的表達取肝臟組織15mg，用天根總RNA提取試劑盒提取總RNA，定量后每組各取2μg逆轉(zhuǎn)錄cDNA，然后用逆轉(zhuǎn)的cDNA2μL為模板，采用PCRMaster-Mix試劑進行PCR反應擴增SERBP-1和ACCα目的片段。PCR擴增反應條件如下:98℃預變性2min，98℃變性10s、SERBP-1為46.6℃退火(ACCα為47.8℃退火)30s、72℃延伸35s，循環(huán)次數(shù)34次;最后再延伸5min。PCR反應產(chǎn)物在含核酸染料(1μL核酸染料配比100mL瓊脂糖溶液)的1.6%瓊脂糖凝膠中電泳30min，電壓110V，電泳完成后用凝膠成像儀拍照采集圖像，ImageJ軟件計算各條帶的熒光強度值，以β-actin作為內(nèi)參進行標準對照。每組實驗重復3次。SERBP-1引物設計為:PrimerA:5'CGTTCGCCATAACCAAGTAGAG3'，PrimerB:5'GGCGATGCTGTACACTGTTGA3'，產(chǎn)物長度為126bps。ACCα引物設計為:PrimerA:5'AGCGCTACCGTTCCTCTATCAA3'，PrimerB:5'GCTGTAAGAAGCGGATGTAGTCG3'，產(chǎn)物長度為118bps。β-actin引物設計為:PrimerA:5'GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3'，PrimerB:5'ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3'，產(chǎn)物長度為123bps。1.2.6WesternBlot檢測SERBP-1、ACCα蛋白的表達取肝臟組織100mg用組織細胞裂解液制作勻漿，BCA法測定蛋白質(zhì)含量，取樣本SERBP-1為100μg(ACCα為60μg)進行SDS電泳，半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2h后加入相應多克隆一抗，搖床劇烈搖半小時后4℃過夜，洗膜3次，每次15min，加入相應的HRP標記的二抗孵育，洗滌后與ECL發(fā)光試劑反應，曝光洗片，掃描圖像后用ImageJ軟件計算各條帶的灰度值，以βactin作為內(nèi)參進行標準對照。每組實驗重復3次。1.3統(tǒng)計學處理所有的數(shù)據(jù)均用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行處理分析。計量資料均以均數(shù)±標準差()表示。多組間兩兩比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane'sT2法。檢驗水準=0.05。2實驗結(jié)果2.1大鼠肝臟HE染色比較圖HE染色可明顯看出，模型對照6周組出現(xiàn)不同程度的脂肪變性及空泡樣變，肝細胞極度腫脹呈圓形，體積較空白對照6周組明顯增大;富硒靈芝6周組脂肪變性程度及細胞腫脹明顯減輕，炎性細胞浸潤及壞死灶較模型對照組明顯減少，空白對照6周組看不到任何脂滴及壞死特征;12周組大鼠肝臟三個組HE染色圖片基本情況與6周組相似，但富硒靈芝12周組組比較富硒靈芝6周組進一步好轉(zhuǎn)，詳見圖1。圖1大鼠肝臟HE染色Fig.1HEstainingofratliver2.2大鼠肝功能比較2.2.1治療6周后大鼠肝功能比較治療6周后大鼠LDH、AST以及ALT富硒靈芝6周組與模型對照6周組相比，P＜0.05;堿性磷酸酶(AKP)、r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(r-GT)富硒靈芝組與模型組相比，雖然沒有統(tǒng)計學意義，但仍可以看出明顯的變化，詳見表1。表1各組大鼠肝功能治療6周指標比較(n=10，)Table1Comparisonofliverfunctionindicatorsofdifferentgroupswith6weeks’treatment(n=10，)表1各組大鼠肝功能治療6周指標比較(n=10，)Table1Comparisonofliverfunctionindicatorsofdifferentgroupswith6weeks’treatment(n=10，)注:與模型對照組比較，*P＜0.05。Note:Comparewithmodelcontrolgroup，*P＜0.05.2.2.2治療12周后大鼠肝功能比較治療12周后大鼠LDH與AST、ALT富硒靈芝12周組與模型對照12周組相比，P＜0.05，AKP與r-GT富硒靈芝12周組與模型對照12周組相比，無統(tǒng)計學意義，詳見表2。表2各組大鼠肝功能治療12周指標比較(n=10，)Table2Comparisonofliverfunctionindicatorsofdifferentgroupswith12weeks’treatment(n=10，)表2各組大鼠肝功能治療12周指標比較(n=10，)Table2Comparisonofliverfunctionindicatorsofdifferentgroupswith12weeks’treatment(n=10，)注:與模型對照組比較，*P＜0.05。Note:Comparewithmodelcontrolgroup，*P＜0.05.2.3大鼠氧化和抗氧化能力比較2.3.1治療6周后大鼠氧化和抗氧化能力比較富硒靈芝6周組血清GSH、血清MDA、肝臟SOD、肝臟MDA以及肝臟GSH與模型對照組比較有明顯的統(tǒng)計學意義，P＜0.05，詳見表3。表3治療6周后大鼠氧化和抗氧化能力比較(n=10，)Table3Comparisonofoxidationandantioxidantcapacityofdifferentgroupswith6weeks’treatment(n=10，)表3治療6周后大鼠氧化和抗氧化能力比較(n=10，)Table3Comparisonofoxidationandantioxidantcapacityofdifferentgroupswith6weeks’treatment(n=10，)注:與模型對照組比較，*P＜0.05。Note:Comparewithmodelcontrolgroup，*P＜0.05.2.3.2治療12周后大鼠氧化和抗氧化能力比較富硒靈芝血清GSH、血清MDA、肝臟SOD、肝臟MDA、肝臟GSH與模型組相比P＜0.05，詳見表4。表4治療12周后大鼠氧化和抗氧化能力比較(n=10，)Table4Comparisonofoxidationandantioxidantcapacityofdifferentgroupswith12weeks’treatment(n=10，)表4治療12周后大鼠氧化和抗氧化能力比較(n=10，)Table4Comparisonofoxidationandantioxidantcapacityofdifferentgroupswith12weeks’treatment(n=10，)注:與模型對照組比較，*P＜0.05。Note:Comparewithmodelcontrolgroup，*P＜0.05.2.4SREBF-1與ACCαmRNA表達2.4.1大鼠SERBF-1mRNA表達與模型對照組相比，富硒靈芝6周組大鼠肝臟SERBF-1的mRNA表達稍有改善，但差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。12周SERBF-1的mRNA表達與模型對照組相比有明顯的統(tǒng)計學意義，經(jīng)檢驗P＜0.05(圖2)。圖2肝臟組織中SREBF-1mRNA的表達Fig.2LiverSREBF-1mRNAexpression2.4.2大鼠ACCαmRNA表達與模型對照組相比，富硒靈芝6周組大鼠肝臟ACCα的mRNA表達即具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。12周ACCα的mRNA表達幾乎恢復到正常的水平，詳見圖3。圖3肝臟組織中ACCαmRNA的表達Fig.3LiverACCαmRNAexpression2.5SREBF-1與ACCα酶蛋白表達2.5.1大鼠SERBF-1蛋白表達富硒靈芝6周組與模型對照6周組相比，差別具無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);12周富硒靈芝組與模型對照組相比，差距具有統(tǒng)計學意義P＜0.05(圖4)。2.5.2大鼠ACCα蛋白表達富硒靈芝6周組與模型對照6周組相比，差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);12周富硒靈芝組與模型對照組相比，差距也具有統(tǒng)計學意義，同時富硒靈芝12周組要明顯的好于富硒靈芝6周組，幾乎達到了空白對照組的水平(圖5)。圖4肝臟組織中SREBF-1蛋白的表達Fig.4LiverSREBF-1proteinexpression圖5肝臟組織中ACCα蛋白的表達Fig.5LiverACCαproteinexpression圖6空腹胰島素抵抗指數(shù)Fig.6Fastinginsulinresistanceindex2.6空腹血糖胰島素抵抗指數(shù)空腹胰島素抵抗指數(shù)比較，6周時模型組大鼠明顯要高于空白組，經(jīng)富硒靈芝治療后，只有略微的降低，12周時富硒靈芝組胰島素抵抗指數(shù)與模型組相比呈現(xiàn)出統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見圖6。3討論NAFLD在臨床上指病變主體為肝小葉，以肝實質(zhì)細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征，但卻無過量飲酒史的一種病理綜合征，其疾病譜包括單純性脂肪肝(nonalcoholicsimplefattyliver，NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)、及其相關脂肪性肝纖維化和肝硬化等［3］。2012年沈峰等［4］在上海國際消化系統(tǒng)疾病會議中報道顯示在我國當前城市人口NAFLD的發(fā)生率約31%，我國貧困地區(qū)NAFLD的患病率也在12%左右。早期的研究認為，NAFLD預后良好，進展緩慢甚者基本不進展。但近來研究顯示，NAFLD如果不加以治療或預防，可導致約20%的NAFLD患者進展為肝硬化，其中30%～40%患者死于肝相關疾?。?］，因此當前NAFLD已成為威脅我國人民健康的疾病之一。NAFLD發(fā)病機理的研究，目前醫(yī)學界普遍接受的是1998年Day［5］提出的“二次打擊學說”，“二次打擊學說”分為“第1次打擊”和“第2次打擊”二個部分，“第1次打擊”即指脂肪在肝細胞內(nèi)過量儲積;有研究顯示［6］，IR是NAFLD第一次打擊的始動及中心環(huán)節(jié)，可能貫穿于NAFLD發(fā)病全過程。IR的高低與調(diào)節(jié)脂肪生成的轉(zhuǎn)錄因子SREBF-1密切相關［7］。胰島素的高表達是造成SREBF-1升高的關鍵，SREBF-1是調(diào)節(jié)肝臟脂肪合成有關的酶，其過度表達可使ACCα的mRNA表達水平升高，ACCα主要參與脂肪酸的合成［8］，它是催化脂肪酸合成的第一步反應，即ACCα合成丙二酰輔酶A，丙二酰輔酶A在脂肪酸碳鏈延長酶系作用下合成長鏈脂肪酸，促進脂肪變性發(fā)生，造成脂肪顆粒在肝臟內(nèi)聚集，從而導致非酒精性脂肪肝的發(fā)生。本文的研究結(jié)果提示:用富硒靈芝水給予高脂飲食造成的NAFLD大鼠治療，胰島素抵抗指數(shù)在6周時發(fā)生了微小改變，到12周時呈現(xiàn)出統(tǒng)計學意義，大鼠SREBF-1mRNA和蛋白變化趨勢與胰島素抵抗指數(shù)變化一致，而ACCαmRNA和蛋白表達則相當明顯，其不僅6周即發(fā)生了明顯的改變，12周時ACCα的表達幾乎恢復到正常對照組的水平(P＜0.05)，分析原因可能是由于富硒靈芝在初始時不可以直接通過降低胰島素抵抗來直接作用與大鼠SREBF-1基因的表達，但卻可以明顯抑制SREBF-1管控因子ACCα的表達，通過抑制大鼠ACCαmRNA和蛋白的表達，有效的保護了脂肪顆粒在肝臟內(nèi)的積累，而在12周時，其SREBF-1的表達呈現(xiàn)出統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，這可能是由于ACCα的降低，促進了肝臟脂肪顆粒的代謝，從而進一步反作用于SREBF-1的表達，綜合提示:富硒靈芝可有效降低大鼠肝臟SREBF-1與ACCα的表達，從而減緩了首次打擊帶來的危害，以達到改善肝功能，保護肝臟的功效。氧化應激與脂質(zhì)過氧化損傷是脂肪肝受到第二次打擊進一步發(fā)展的重要因素［9］。當肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度堆積到一定程度時，就會出現(xiàn)以線粒體為中心的一條或多條途徑促進氧化應激，導致脂質(zhì)過氧化，最終加速肝細胞損傷，甚至導致肝細胞死亡及肝纖維化。超氧化物歧化酶(SOD)［10］是超氧離子自由基的專一特效金屬歧化酶，通過清除自由基，起到保護機體的作用，它對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護肝細胞免受損傷。脂質(zhì)過氧化后產(chǎn)生MDA增加，MDA增加使細胞內(nèi)抗氧化劑SOD消耗增加，含量顯著性下降［11］。本文的研究結(jié)果顯示:富硒靈芝治療6周后，與模型對照組相比，血清GSH、血清MDA，肝臟SOD、肝臟GSH以及肝臟MDA相比，均發(fā)生了明顯的改變，P＜0.05。富硒靈芝治療12周后，血清GSH、血清MDA，肝臟SOD、肝臟GSH以及肝臟MDA5個指標與模型對照組相比，變化更加明顯(P＜0.05)，其中肝臟SOD水平幾乎回到了正常的水平，結(jié)合本次治療后，肝功能水平的明顯好轉(zhuǎn)，綜合提示:富硒靈芝可明顯提高高脂飲食所誘導的非酒精性脂肪肝病抗氧化能力，降低肝臟二次打擊的危害，有效的保護肝臟。綜上所述，本文研究結(jié)果顯示:富硒靈芝可通過抑制非酒精性脂肪肝病大鼠的肝臟組織ACCα蛋白的表達，同時減弱二次打擊學說中第二次打擊對肝臟的進一步傷害，以降低肝臟的氧化能力，提高抗氧化能力，從而達到降低肝異常指數(shù)，治療非酒精性脂肪肝病，但本次治療周期時間為12周，提示。富硒靈芝治療非酒精性脂肪肝可能藥效療程較長，需長期服用。1XiangCG(向昌國)，LiWF(李文芳)，RenH(任浩)，etal.SeleniumcontentdeterminationinediblepartsofcropsinZhangjiajiecity.NatProdResDev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:1084-1088.2YangY(楊洋)，WuXY(吳小勇)，ZhangZ(張湛)，etal.FermentationofGanodermalucidumforseleniumenrichmentandtheantioxidantcapabilityoftheproteinproduct.ModFoodSciTechnol(現(xiàn)代食品科技)，2010，26:1349-1353.3ZhuLX，BakerSS，GillC，etal.Characterizationofgutmicrobiomesinnonalcoholicsteatohepatitis(NASH)patients:AconnectionbetweenendogenousalcoholandNASH.Hepatology，2013，57:601-609.4TanwarS，TremblingPM，ThorburnD，etal.PWE-286Directserummarkersaremoreaccuratethansimplemarkerpanelsforthedetectionoffibrosisinnon-alcoholicfattyliverdisease(NAFLD).Gut，2012，61:A414.5ShenF(沈峰)，WangYQ(汪余勤)，F(xiàn)anGJ(范建高).2012Shanghaiinternationalmeetingofdigestivediseases.ChinJFrontiersMedSci，ElectrVer(中國醫(yī)學前沿雜志.電子版)，2012，4:1-4.6DayCP.Steatoh