DB37-T 4639.1-2023豬疫病診斷技術(shù) 第1部分：圓環(huán)病毒

ICS65.020.30CCSB41ICS65.020.30CCSB41山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T4639.1—2023豬疫病診斷技術(shù)第1部分：圓環(huán)病毒Diagnosistechnologyofswineepidemicdisease—Part1:Circovirus20232023080320230903山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB37/T4639《豬疫病診斷技術(shù)》的第1部分。DB37/T4639已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：圓環(huán)病毒。本文件代替DB37/T1827—2011《豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR檢測(cè)技術(shù)》，與DB37/T1827—2011相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：（）；（，2011見2011）；（，20111）（2章見第5，20112）；（6.1、6.2）；（見6.3，20113）；i)（本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2011年首次發(fā)布為DB37/T1827—2011；——本次為第一次修訂。本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2011年首次發(fā)布為DB37/T1827—2011；——本次為第一次修訂。引 言（PCVD）（PCV）（PMWS）（PDNS）（PNP）1.111豬疫病診斷技術(shù)第1部分：圓環(huán)病毒范圍（PorcineCircovirusType（PorcineCircovirusType1，PCV2）和3（PorcineCircovirusType3，PCV3；）PCR本文件適用于豬圓環(huán)病毒1型、2型和3型的快速分子診斷。（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4試劑或材料GB/T6682磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：取磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.27g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.42g、氯化鈉（NaCl）8（KCl）0.2g800mLpH7.41000mLDNA/RNAPCR5儀器設(shè)備PCR≥8000g0.0001。5.6冰箱：2℃～8℃，-20℃以下和-70℃以下。5.76診斷方法豬是PCV(PMWS)10～20(PDNS)CT)出生后3PNP)與保育豬和育肥豬發(fā)生的呼吸道病有關(guān)。PNP的確診主要依據(jù)組織病理學(xué)變化，表現(xiàn)為增生性和壞死性肺炎，病豬主要表現(xiàn)呼吸困難，肺臟見點(diǎn)狀出血。2～510按照GB19489規(guī)定，取細(xì)胞培養(yǎng)樣品。按照NY/T541規(guī)定采集病死豬的淋巴結(jié)、脾臟、腎臟和肺臟等組織樣品。樣品2～82～82435500μLPBS（4.2）6000r/min45s5000r/min離心5min次，3000r/min5min采用DNA2采用DNA220（6.3.3）200μL1.5mL500μL30s2min；，6000r/min5min；注：此時(shí)病毒DNA會(huì)吸附再管柱底部的膜上。500μL，6000r/min5min18000r/min10min2min50μL1min；8000r/min1.5minDNA6.3.4.2熒光PCR擴(kuò)增設(shè)25μLPCRPCRA表1熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系序號(hào)組分用量12×SYBR?GreenProTaqHSPremix*612.5210μMPCV-F1.0310μMPCV1-R1.0410μMPCV2-R1.0直接讀取檢測(cè)樣品的熔解曲線峰值溫度，溫度誤差0.1℃范圍內(nèi)。在陽(yáng)性和陰性成立前提下，樣品檢測(cè)結(jié)果判定如下：84PCV1；85PCV2；82PCV3；8485PCV1PCV2；8482PCV1PCV3；8582PCV2PCV3；848582PCV1、PCV2PCV3。表1熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系（續(xù)）序號(hào)組分用量510μMPCV3-R1.06模板DNA1.57ddH2O7檢測(cè)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照，熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見表2。表2熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件序號(hào)進(jìn)程反應(yīng)條件反應(yīng)時(shí)間1預(yù)變性95℃30s2變性95℃30s3退火62℃30s4延伸72℃10s5循環(huán)數(shù)（2～4）40—6信號(hào)采集退火時(shí)采集—附錄A（）PCR熒光定量PCR擴(kuò)增引物見表A.1。表A.1熒光定量PCR擴(kuò)增引物引物名稱序列PCV-F5’-TKGATGATYTTTTATGGSTGG-3’PCV1-R5’-GTCAGCAGTTGAGGACTACCATT-3’PCV2-R5’-AGTAATCCGCCGATAAAGAGC-3’PCV3-R5’-CTCCTAAACAAGGCCTCCAACT-3’注：簡(jiǎn)并堿基K：G/T；Y：