關(guān)于研究蛋白質(zhì)細(xì)胞定位的幾種方法

關(guān)于研究蛋白質(zhì)細(xì)胞定位的幾種方法姓名：甄萍萍導(dǎo)師：梁建生導(dǎo)言

真核細(xì)胞具有復(fù)雜的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種細(xì)胞器，每種細(xì)胞器都有一組特定的蛋白。真核細(xì)胞除葉綠體，線粒體能少量合成蛋白外，絕大部分蛋白是在胞漿或粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，最終運送到不同地點，形成成熟蛋白并行使功能。轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物中很大一部分是以前體蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信號，可引導(dǎo)蛋白在胞內(nèi)定位。蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位問題，是細(xì)胞生物學(xué)研究的中心問題，也是分子生物學(xué)研究的熱門話題。目前，這方面的工作己取得很人進展。細(xì)胞器不同，相應(yīng)的靶向蛋白的定位過程也不同。研究蛋白亞細(xì)胞定位主要的幾種方法

免疫熒光技術(shù)

免疫膠體金標(biāo)記

與gfp構(gòu)建融合基因，用熒光顯微鏡觀察

免疫熒光技術(shù)

根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)得原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原或抗體復(fù)合物上含有各種顏色的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激光的照射而發(fā)出各種顏色的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。S.pagny等(2003)將XYIT36:GFP轉(zhuǎn)入擬南芥，檢測發(fā)現(xiàn)熒光出現(xiàn)在高爾基體。使用植物L(fēng)ewis(高爾基體標(biāo)志分子)抗體以及BIP(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志分子)抗體進行免疫熒光標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)GFP的綠色熒光與使用Lewis抗體所做的免疫熒光存在共定位，而與BIP分布在不同部位。說明XYIT36:GFP定位在高爾基體。免疫膠體金標(biāo)記

金標(biāo)法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫電鏡。當(dāng)用金標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)時，在光鏡水平膠金液呈現(xiàn)鮮艷的櫻紅色，不需加外進行染色。在電鏡水平，金顆粒具有很高的電子密度，清晰可辨。免疫膠體金標(biāo)記電鏡技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞及組織內(nèi)蛋白的定位研究，金標(biāo)法是利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電的性質(zhì)，使其與抗體相吸引，從而將抗體標(biāo)記。電鏡水平的免疫金染色是目前較理想的免疫定位方法，具有特異性強、靈敏度高、定位準(zhǔn)確和具有雙重標(biāo)記功能等優(yōu)點。例如用連有15nm金顆粒的GFP單克隆抗體以及連有l(wèi)Onm金顆粒的過氧物酶體的標(biāo)志酶抗體作為一抗進行免役金標(biāo)，證明CAT1-GFP定位在過氧物酶體(AkaneKamigakieta1.,2003)。GFP及其在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

簡介GFP海洋生物發(fā)光是個非常普遍的現(xiàn)象。從原生生物到脊椎動物均有生物發(fā)光，如海螢，磷蝦，腔腸動物等。從不同動物體內(nèi)提取的熒光蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不盡相同，不同動物熒光發(fā)生機制有很大差別。多管水母體內(nèi)存在兩種發(fā)光蛋白綠色熒光蛋白:GFP和aequorin。當(dāng)aequorin與3個Ca2+結(jié)合后，即發(fā)生氧化反應(yīng)并發(fā)射藍(lán)光，最大發(fā)射波長469nm。GFP被紫外光或藍(lán)光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光(Morise,H.，Shimomura,1974)。GFP在水母體內(nèi)的發(fā)光機制如下：

GFP熒光的產(chǎn)生主要歸功于分子內(nèi)第65,66,67位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團的功效。翻譯出的蛋白折疊環(huán)化后，在O2存在下分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰基對第65位絲氨酸的羧基的親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的。a-β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團與咪唑基結(jié)合。這樣GFP分子中形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團，該過程可自動催化合成(HeimR,DouglasCP.,1994)

GFP晶體結(jié)構(gòu)(如圖)顯示：

蛋白中央是一個圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長420nm,寬240nm，由11個