膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測-

器材籌備濃汁標(biāo)本1支，糞便標(biāo)本1支；碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科鑷子2把；伊紅美蘭平板2個，營養(yǎng)瓊脂平板5個。自然界中的微生物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的微生物大約13萬5千多種，被認(rèn)為格外危險的有600種，在人間傳染的病原微生物380種。這些微生物存在于地球的各個角落，從寒冷的極地到酷熱的赤道，從4.2千米地層深處到85千米高空（芽孢）,均有它們的蹤跡?？諝狻⑺?、土壤、人體的體表以及與外界相通的腔道，均有不同種類和數(shù)量的微生物存在。存在于人體消化道的細(xì)菌超過800種，數(shù)量可達(dá)100萬億（1014），菌體重量1～1.5公斤。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗

綜合性實驗三

ComprehensiveExperiment3

空氣與人體體表細(xì)菌學(xué)檢查空氣的細(xì)菌學(xué)檢查P38手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查P41空氣的細(xì)菌學(xué)檢查P38空氣是人類賴以生存的環(huán)境之一，也是重要的疾病傳播媒介?？諝庵械牟≡饕獊碜圆∪说呐判刮锖头置谖铩＿@些污物，因風(fēng)吹，以及人類日?；顒樱詺馊苣z的形式懸浮于空中，使空氣受到污染。環(huán)境：不利于微生物生長。種類：主要是病毒、真菌和細(xì)菌。在醫(yī)院，公共場所致病菌的數(shù)量比較多。作用：可飛快全球傳播。危害：引起培育基、生物制品的污染，病原菌引起呼吸道傳染病。實驗方法：自然沉降法是依據(jù)空氣中細(xì)菌氣溶膠粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培育基表面；培育以后，計數(shù)菌落形成單位（colonyformingunit，CFU），了解空氣的污染情況。實驗步驟：每組1個營養(yǎng)瓊脂平板，選擇采樣地點（實驗室、宿舍、衛(wèi)生間、飯?zhí)没蛉芜x地點），將平板蓋打開，蓋朝下放置在平板旁，平板暴露于空氣中15分鐘，然后蓋上蓋子，作標(biāo)記。37℃溫箱培育24小時，觀察結(jié)果?！顲FU/m3＝50000N÷AT≈86N(直徑7cm平板）。N：平板上的菌落數(shù)。A：平板面積(平方厘米)。T：采樣時間(分鐘)。空氣的細(xì)菌學(xué)檢查暴露法（ExposureMethod)組號地點時間(min)菌落形成單位(CFU)1衛(wèi)生間152食堂153門診大廳154呼吸科病房155呼吸科ICU156外科病房157外科ICU158外科治療室159嬰兒室1510實驗室15手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查P41

在日常生活中，手的接觸范圍廣，使用頻率高，受到污染的機(jī)會也最多。一只外觀比較“干凈”的手，可攜帶10萬個細(xì)菌、200多種病毒。因此，經(jīng)手傳播的疾病很多，范圍很廣，包括腸道傳染病、部分呼吸道傳染病、皮膚傳染病，以及一切可經(jīng)手間接傳播的疾病。常住菌：存在于皮膚表面、毛囊和皮脂腺。種類和數(shù)量比較恒定。附著在皮膚上比較堅固，用一般洗手方法，常不易去除。暫住菌：存在于皮膚表面常常暴露的部位。暫住菌是外來的非正常菌群，種類和數(shù)量不定。引起人類致病的通常是暫住菌。醫(yī)務(wù)人員，常常要與病人接觸，不管是直接接觸，還是間接接觸，都有傳播病菌的可能。雖然病菌的直接來源是患者,但是造成病菌集中的主要途徑則是氣溶膠和醫(yī)務(wù)人員的手。因此，常常洗手和消毒是掌握醫(yī)院內(nèi)交叉感染的主要方法。實際上，預(yù)防感染措施中，最簡潔又十分有效的方法就是洗手。據(jù)測定，只用自來水洗手可使暫住菌總數(shù)削減40%，用肥皂洗手可削減80%以上。洗手？常規(guī)的洗手方法（甲和丙操作）將手充分浸濕，涂抹肥皂或洗滌液。反復(fù)搓揉雙手，搓揉時間不應(yīng)少于30秒。用流水沖洗干凈，整個洗手過程不少于1分鐘?！苡行У厝コ蠖鄶?shù)手上的暫住菌。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗室標(biāo)準(zhǔn)洗手方法（乙和丁操作）用流淌的水沖洗，將手充分浸濕，涂抹肥皂、洗滌液。分別搓擦10～15次。保持雙手低于肘部，流水沖洗一分鐘以上。1.掌心對掌心搓擦2.手指交叉掌心對手背搓擦3.手指交叉掌心對掌心搓擦4.兩手互握互搓指背5.拇指在掌中轉(zhuǎn)動搓擦6.指尖在掌心中搓擦1.掌心對掌心搓擦2.手指交叉掌心對手背搓擦3.手指交叉掌心對掌心搓擦4.兩手互握互搓指背5.拇指在掌中轉(zhuǎn)動搓擦6.指尖在掌心中搓擦醫(yī)務(wù)人員洗手指征接觸傳染病患者之后。接觸攜帶多耐藥性細(xì)菌的病人之后。接觸病人的血液、體液、分泌物和排泄物之后。接觸高危病室兩個病人之間、新生兒室兩個新生兒之間接觸舊錢幣之后。上廁所前后。進(jìn)行微生物操作或作血、尿等生化、免疫測定之后。在施行各種手術(shù)前后。診斷、治療、護(hù)理格外易感染的病人之前。進(jìn)食之前。132

4132

4手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查第1格為洗手前，第2格為洗手后，第3格為消毒后，第4格空白對比。

2人1個營養(yǎng)瓊脂平板上:甲、丙→常規(guī)洗手下:乙、丁→標(biāo)準(zhǔn)洗手甲（丙）乙（?。┍♂t(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗

綜合性實驗一(P2)膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(二）臨床標(biāo)本的檢查程序細(xì)菌的分離與培育P7※目的要求：掌握分離、純化微生物的基本操作技術(shù)。常見病原性球菌的檢查程序P47：直接涂片、革蘭染色、鏡檢膿汁、痰、咽部分泌物觀察菌落性狀、溶血性、色素血瓊脂平板培育涂片染色鏡檢挑取可疑菌落生化反應(yīng)↑純培育動物實驗藥敏實驗血液、穿刺液→肉湯增菌培育→培育液涂片染色境檢常見腸道致病菌的檢查程序P48：糞便→SS瓊脂、伊紅美藍(lán)平板培育→挑取可疑菌落↑↓血清學(xué)鑒定血、骨髓→增菌培育雙糖鐵培育基染色鏡檢生化反應(yīng)

平板劃線分離法

StreakPlateMethod借助于劃線，將混雜的多種細(xì)菌，在固體培育基表面分散成單個細(xì)菌，并固定在某一點上。培育以后細(xì)菌各自分裂繁殖，形成肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)?！诠腆w培育基表面或基內(nèi)，由單個細(xì)菌在局部位置不斷增值的稠密群體稱為單菌落?！诠腆w培育基表面，由多個菌落融合在一起形成的細(xì)菌積累物,稱為菌苔。平板分區(qū)劃線分離法步驟（5區(qū)）接種環(huán)燒灼滅菌，以免污染標(biāo)本。取標(biāo)本在平板表面上方密集涂布5～10mm2。燒掉接種環(huán)上多余的標(biāo)本（火焰背面烤干→燒灼）?；蝿悠桨澹?dāng)看到平板表面象鏡面有反光的時候，保持這個角度，劃線時就能看清劃線痕跡，以便掌握劃線。接種環(huán)與平板呈30～40度角，通過密集涂布部分1～3次，使接種環(huán)重新沾上少量標(biāo)本(細(xì)菌)，然后在平板表面，以曲線的形式，作大幅度來回連續(xù)劃線，邊劃邊退，線段要劃得長而密集，每區(qū)劃線不少于30條。轉(zhuǎn)動平板，接種環(huán)通過第一區(qū)1次，同樣的方法劃其次區(qū)。如此依次劃完3～5區(qū)。接種環(huán)燒灼滅菌，以免污染環(huán)境。將平板倒置37℃培育18～24h?！锍浞掷闷桨迕娣e，不能劃破瓊脂。第四區(qū)平板劃線分離小組分工甲→膿汁標(biāo)本→營養(yǎng)瓊脂平板(nutrientagarplate)乙→膿汁標(biāo)本→營養(yǎng)瓊脂平板(nutrientagarplate）丙→糞便標(biāo)本→伊紅美藍(lán)平板(eosinmethyleneblueplate）丁→糞便標(biāo)本→伊紅美藍(lán)平板(EMBplate）實驗分組倆倆相對4人為一個小組,組號編在電源插座上。每組按從前到后,從左到右的挨次，分別編號為甲、乙、丙、丁。

甲乙4丙丁甲乙3丙丁甲乙2丙丁甲乙1丙丁甲乙5丙丁甲乙8丙丁甲乙7丙丁甲乙6丙丁甲乙10丙丁甲乙9丙丁講臺桿12～14cm環(huán)直徑2～4mm柄10cm接種環(huán)inoculating

loop桿12～14cm柄10cm針4～6cm接種針straightwireinoculating

wire,inoculating

needle接種環(huán)燒灼滅菌

FlameLoop使用前，直接在酒精燈上燒灼滅菌，把環(huán)和金屬絲燒紅即可。使用后，先在火焰背面將把環(huán)上標(biāo)本烤干，再燒灼滅菌，以免標(biāo)本汽化，爆烈四濺，污染環(huán)境。金屬桿快速通過火焰2～3次，殺滅表面微生物。酒精燈無菌操作區(qū)外焰:又稱氧化焰,火焰呈淡紫色,溫度較高。無菌操作區(qū):火焰周圍10～20cm范圍內(nèi)。環(huán)面水平離開液面：快速6ul,慢速2ul。環(huán)面垂直離開液面：快速3ul,慢速1ul。接種環(huán)取液體標(biāo)本的方法：環(huán)直徑3mm①②③無菌取材基本步驟接種環(huán)、平板的握持方法接種環(huán)、平板的握持方法正確correct錯誤incorrect平板劃線示意圖涂布spreading細(xì)菌大多分散成單個。細(xì)菌前段很多，后段太少，分離效果差。5～10mm2↓＞30條線/區(qū)平板劃線不少于150條線37℃培育24小時

37℃培育24小時

生物平安警告接種環(huán)接種平板一次，可產(chǎn)生幾十個微生物氣溶膠顆粒。氣溶膠粒徑＞100um沉降很快，＜50um在0.4s內(nèi)集中開，＜5um通過呼吸道直接到達(dá)肺泡。Pike博士對實驗室感染統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不明緣由的感染高達(dá)82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中集中引起的。實驗時應(yīng)坐著，在火焰周圍10～20厘米內(nèi)操作，保持安靜、有序，盡量少說話、少走動，以免感染病原菌。思考題為何取鏈球菌作為空氣的衛(wèi)生指標(biāo)之一?為什么金黃色葡萄球菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見的重要病原菌?為什么接種環(huán)使用前后必須燒灼滅菌？忽視了有什么危害?做細(xì)菌培育時，平板為什么要倒置?培育細(xì)菌的常用方法有哪些?從臨床標(biāo)本中分離病原菌，應(yīng)注意哪些事項?實驗內(nèi)容空氣的細(xì)菌學(xué)檢查P38營養(yǎng)瓊脂平板(黃色,1組1個）手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查P41營養(yǎng)瓊脂平板(黃色,2人1個→劃分8格）平板劃線分