kozak基因重組智能腺病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)研究

kozak基因重組智能腺病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)研究

基因治療是將具有治療作用的基因或dna（rn）段引入人體的靶細(xì)胞，相應(yīng)地調(diào)節(jié)不同類型疾病的分子變化，并發(fā)揮治療作用?；蛑委煹难芯亢蛻?yīng)用起源于對遺傳病的治療,但近年來腫瘤基因治療的發(fā)展卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了遺傳病。常見的抗癌基因有p53、p21、p27、p16、PTEN、FHIT、BRCA1/BRCA2等。由于在人類惡性腫瘤中有50%帶有p53基因突變,且p53基因的突變與病情的發(fā)展、腫瘤的轉(zhuǎn)移以及對放、化療的敏感性和預(yù)后均密切相關(guān),因此該基因在目前的腫瘤基因治療研究中倍受關(guān)注。p53的基本功能為核轉(zhuǎn)錄因子,其抗腫瘤的生物學(xué)活性主要表現(xiàn)在阻滯腫瘤細(xì)胞周期,可作用于G1/S期和G2/M期,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤血管生成,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性,抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,增加腫瘤細(xì)胞對放、化療以及熱療的敏感性等。重組人p53腺病毒應(yīng)用于臨床治療惡性腫瘤已有十幾年的歷史,雖然取得了一些令人滿意的療效,但療效尚不十分確切。究其原因,主要是由于p53蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量相對不足所致。本研究利用一種新的重組腺病毒載體系統(tǒng)AdMaxTMHi-IQ,并在基因5′端加入Kozak規(guī)則序列,最終同時(shí)實(shí)現(xiàn)了重組腺病毒的高效包裝與p53基因的高效表達(dá)。1.材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)和動物AdMaxTMHi-IQ重組腺病毒載體系統(tǒng)pDC515(io)、pBHGfrt(del)E1、3FLP等質(zhì)粒和293IQ細(xì)胞購自北京本元正陽基因技術(shù)有限公司;pUCmT載體購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞和人肺癌A549細(xì)胞由廣州中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;人p53cDNA由本公司克隆并保存。1.2生物工程技術(shù)服務(wù)TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司;Trizolreagent購自invitrogen;FermentasRebertAidFirstStrandcDNASynthesisKit購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;鼠抗人p53一抗、HRP-人p53二抗購自尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)(北京)有限公司;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自廣州展晨生物科技有限公司。1.3koraralataqtmnda分析根據(jù)已發(fā)表的人野生型p53cDNA全序列,設(shè)計(jì)合成2條引物,上游引物P1:5′-ATAGGATCCACCATGGAGGAGCCGCAGTC-3′;下游引物P2:5′-ATAGGATCCATGTCAGTCTGAGTCAG-3′,上下游引物中均插入BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC和酶切保護(hù)堿基ATA,并在上游引物BamHI酶切位點(diǎn)后加入一個(gè)A堿基,上游引物內(nèi)整合入Kozak規(guī)則序列CCACCATGG。以上述人野生型p53cDNA為模板,采用TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶,通過PCR擴(kuò)增人p53腫瘤抑制基因編碼區(qū),反應(yīng)條件為:94℃2min;94℃30s,45℃40s,72℃60s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物與pUCmT載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(深圳市源興生物醫(yī)藥科技有限公司李進(jìn)研究員惠贈),藍(lán)白斑篩選pUCm-khp53陽性重組子,再用上游引物P3:5′-AGCACTGTCCAACAACACCA-3′和下游引物P2進(jìn)行PCR篩選,酶切鑒定后,進(jìn)行雙向測序鑒定。1.4bamhi酶切鑒定用BamHI酶切pUCm-khp53和腺病毒穿梭載體pDC515(io),瓊脂糖凝膠電泳后分別切膠,回收插入片段與載體片段,以摩爾比為3∶1的比例連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,用引物P3和P2經(jīng)PCR初篩出陽性克隆,再在載體多克隆位點(diǎn)的上游設(shè)計(jì)1條與正鏈一致的引物P4:5′-ACATCCACTTTGCCTTTCTC-3′,在基因內(nèi)設(shè)計(jì)1條與正鏈互補(bǔ)的引物P5:5′-GGGACAGCATCAAATCATCC-3′,基因若正向插入可擴(kuò)增出片段,若反向插入則無法擴(kuò)增出片段,以此鑒定基因插入方向,并進(jìn)行BamHI酶切鑒定。鑒定正確的載體命名為pDC515(io)-khp53。1.5mdv細(xì)胞重組人馬立克氏體誘導(dǎo)pDC515(io)-khp53腺病毒基因組骨架DNA即pBHGfrt(del)E1,3FLP等質(zhì)粒的大量擴(kuò)增、提取、純化和定量參見文獻(xiàn)方法。將293IQ細(xì)胞復(fù)蘇、擴(kuò)增并鋪板,用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pDC515(io)-khp53與腺病毒基因組骨架DNA(DNA總量為800ng,摩爾比為1:1)共轉(zhuǎn)染293IQ細(xì)胞,同時(shí)設(shè)未感染病毒的細(xì)胞為陰性對照,8d后共轉(zhuǎn)染孔細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變,而陰性對照孔細(xì)胞生長正常,初步可以判定有重組腺病毒產(chǎn)生,至第10天,共轉(zhuǎn)染孔細(xì)胞完全病變,收集病變細(xì)胞及上清,-20～37℃之間反復(fù)凍融3次。取病毒液感染的293IQ細(xì)胞,傳代1次,擴(kuò)增病毒,保存并鑒定。1.6khp33基因缺失菌株對p33的擴(kuò)增重組腺病毒經(jīng)熱裂解制備模板,以P3和P2為引物,PCR擴(kuò)增khp53基因編碼區(qū)內(nèi)277bp的特異片段,來鑒定是否插入了人p53腫瘤抑制基因。1.7陰性對照試驗(yàn)293IQ細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液制成濃度為1×105個(gè)/ml的懸液,以100μl/孔接種于96孔板,同時(shí)按10倍系列稀釋制備病毒稀釋液,并分別感染293IQ細(xì)胞,每排前10個(gè)孔分別加入100μl同一濃度的病毒稀釋液,第11、12孔加入等體積含2%BCS的MEM作為陰性對照。37℃,CO2孵箱中培養(yǎng)10d,倒置顯微鏡下觀察CPE情況,按下述公式計(jì)算重組腺病毒的滴度:T=101+d(S-0.5)IU/ml其中d=Log10(稀釋倍數(shù))=1,S=從第1次稀釋起的陽性比率之和(每個(gè)孔的值,陽性為0.1,陰性則為0),2次平行實(shí)驗(yàn)得到的滴度值相差應(yīng)不超過100.7=5,簡化后該公式為:T=10S+0.5IU/ml。1.8radh-khp33細(xì)胞在細(xì)胞水平上的表達(dá)復(fù)蘇、培養(yǎng)Saos-2細(xì)胞(不表達(dá)p53基因)和A549細(xì)胞(表達(dá)野生型p53基因),分別鋪6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Saos-2細(xì)胞鋪2個(gè),A549細(xì)胞鋪1個(gè)),重組腺病毒rAdMH-khp53按10MOI感染一個(gè)培養(yǎng)皿的Saos-2細(xì)胞,10h后,用Trizolreagent按試劑盒提供的方法提取Saos-2(陰性)、Saos-2+rAdMH-khp53及A549(陽性)細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以各細(xì)胞的cDNA為模板,P3和P2為引物,PCR擴(kuò)增khp53特異片段,同時(shí)PCR擴(kuò)增看家基因GAPDH的特異片段作為內(nèi)對照,并設(shè)空白對照(不加模板擴(kuò)增)。1.9ge的轉(zhuǎn)移各細(xì)胞經(jīng)8步驟同樣處理后,提取細(xì)胞的總蛋白,定量。配制15%的聚丙烯酰胺凝膠,進(jìn)行SDS,在50mA電流下過夜轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)膜后,在5%BSA的PBS中封閉30min,再進(jìn)行Westernblot分析,加入1∶500稀釋的鼠抗人p53一抗,1∶1000稀釋的HRP-人p53二抗,最后在DAB中顯色,條帶達(dá)所需深度時(shí)(1～3min),立即用水洗膜,終止顯色。2.結(jié)果2.1pucm-khp33基因回復(fù)突變體的構(gòu)建以人野生型p53cDNA為模板,通過PCR擴(kuò)增得到khp53基因,見圖1,并克隆到pUCmT載體中,陽性重組子pUCm-khp53經(jīng)PCR及酶切鑒定后雙向測序,與cDNA序列一致,符合預(yù)期結(jié)果。2.2組子的構(gòu)成用PCR方法篩選到khp53基因正向插入pDC515(io)的重組子,見圖2。提取質(zhì)粒后用BamHI酶切,電泳可見在線性化穿梭載體條帶前產(chǎn)生約為1200bp的條帶,見圖3,證實(shí)載體中插入了兩端帶有BamHI酶切位點(diǎn)的khp53腫瘤抑制基因編碼區(qū)片段。2.3rad-kholl-kmp53遺產(chǎn)dnapcr的評估經(jīng)PCR擴(kuò)增可見,6個(gè)克隆均有277bp條帶,陰性對照未擴(kuò)增出條帶,見圖4。證明khp53基因存在于重組腺病毒的基因組中。2.4u3000滴度共接種兩塊96孔板,兩塊板的S值分別為8.8和8.6,滴度分別為2.00×108和1.26×108IU/ml,均值為1.63×108IU/ml。2.5radh-khp33通過rt-pcr檢測ca-pcr檢測ca-pcr擴(kuò)增p33基因表達(dá)以各細(xì)胞總RNA為模板,P3、P2為引物,RT-PCR結(jié)果可見,A549細(xì)胞有p53mRNA的表達(dá),Saos-2細(xì)胞無p53mRNA的表達(dá),rAdMH-khp53感染的Saos-2細(xì)胞10h后有p53mRNA的表達(dá);空白對照未擴(kuò)出條帶。以各細(xì)胞的總RNA為模板,看家基因GAPDH的特異引物為引物,經(jīng)RT-PCR各細(xì)胞均擴(kuò)增出條帶;空白對照未擴(kuò)增出條帶,見圖5。2.6radh-khp65細(xì)胞誘導(dǎo)蛋白印跡Westernblot結(jié)果顯示,Saos-2細(xì)胞總蛋白無p53蛋白印跡,有Actin蛋白印跡;rAdMH-khp53感染的Saos-2細(xì)胞10h后總蛋白的p53蛋白印跡非常大,表明其表達(dá)量非常高,Actin蛋白印跡大小與Saos-細(xì)胞相似;A549細(xì)胞總蛋白有p53蛋白印跡,也有Actin蛋白印跡,見圖6。表明重組腺病毒rAdMH-khp53非常高效地表達(dá)了p53蛋白。3.admadh-khp33的基本特點(diǎn)1979年,Linzer等首先發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有一種蛋白質(zhì)(p53)能與SV40轉(zhuǎn)染細(xì)胞特異性地高親和力結(jié)合。由于它能聯(lián)合SV40產(chǎn)生大量的T抗原,因此一開始將其歸類于腫瘤抗原。1991年,Levine等通過研究,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了myc或ras癌基因的細(xì)胞中,若存在野生型p53基因,則出現(xiàn)生長抑制,就此提出p53基因?qū)儆谝职┗颉53基因突變是許多腫瘤發(fā)生的重要原因之一?；蛲蛔冎饕c(diǎn)突變、等位基因的缺失、基因重排、與腫瘤病毒癌蛋白結(jié)合而失活等。在多種人類腫瘤,如食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸及直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤中均存在p53基因突變,其中在黑色素瘤(原發(fā))中,p53基因突變率高達(dá)97%。P53基因突變的腫瘤常表現(xiàn)為侵襲性增強(qiáng)、預(yù)后差、轉(zhuǎn)移率高和5年生存率下降,并且更容易產(chǎn)生化療藥物耐受和放療不敏感。腺病毒載體作為外源性DNA轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞的工具,具有許多優(yōu)點(diǎn):載體容量較大(7.5kb以上),轉(zhuǎn)染效率極高(體外轉(zhuǎn)染人腫瘤細(xì)胞可達(dá)100%),生產(chǎn)效率高(病毒可在生產(chǎn)細(xì)胞上幾百倍地?cái)U(kuò)增),非整合性感染細(xì)胞,無遺傳毒性,感染能力強(qiáng)(分裂、非分裂細(xì)胞均可被感染),外源基因表達(dá)量高。這些特點(diǎn)使腺病毒特別適合于腫瘤的基因治療及其制品的工業(yè)化生產(chǎn)。人們很早就開始了重組人p53腺病毒治療腫瘤的研究。研究表明,當(dāng)一個(gè)人的正常細(xì)胞由于體內(nèi)外各種因素致使其基因發(fā)生變化,最后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生時(shí),已經(jīng)積累了10000多個(gè)基因水平的改變(如抑癌基因的缺失、點(diǎn)突變、甲基化,原癌基因的重排、擴(kuò)增、突變等等),而腫瘤抑制基因p53的作用不是單一位點(diǎn)作用,如p53蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子,直接與特異的DNA序列作用,可以調(diào)控下游多種基因的表達(dá)?；蛐酒芯堪l(fā)現(xiàn),p53轉(zhuǎn)錄激活從而表達(dá)上調(diào)的有107種基因,轉(zhuǎn)錄抑制導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)的有54種基因;同時(shí),p53蛋白本身也能與多個(gè)胞內(nèi)蛋白相互作用,如癌基因mdm2的基因表達(dá)產(chǎn)物就可與p53蛋白特異地結(jié)合,而抑制p53的功能。因此,相對于腫瘤細(xì)胞中的眾多基因改變,作為基因替代療法的重組人p53腺病毒基因藥物制劑在感染腫瘤細(xì)胞并表達(dá)后,如果p53蛋白的表達(dá)量不高,則很難確切有效地控制腫瘤生長。但是,由于p53基因的表達(dá)同時(shí)有一定的細(xì)胞毒性,因此若在細(xì)胞中的高水平表達(dá)將導(dǎo)致重組腺病毒難以擴(kuò)增到高滴度。本研究使用AdMaxTMHi-IQ腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒rAdMH-khp53,在外源khp53基因上游插入目前啟動真核基因表達(dá)效率最高的鼠巨細(xì)胞病毒啟動子(MCMV),在轉(zhuǎn)錄水平提高基因的表達(dá),并在啟動子與khp53基因之間插入一內(nèi)含子,進(jìn)一步提高基因轉(zhuǎn)錄后m