病毒性疾病標(biāo)本采集保存與檢測課件

病毒性疾病標(biāo)本采集、保存與檢測

中國疾控中心病毒病所

王世文

病毒性疾病標(biāo)本采集、保存與檢測

中國疾控中心病毒病采樣前準(zhǔn)備包括各種采樣現(xiàn)場需要的器械、耗材，無菌標(biāo)本容器，采樣后處理試劑，低溫保存設(shè)備和個人防護裝備，以及各種采樣表格等采樣前準(zhǔn)備明確采樣要求針對不同事件的處置，采樣目的、對象、標(biāo)本種類各不相同，采樣人員需要根據(jù)事件或疫情的特點，制定出詳細的、有針對性的采樣工作程序。內(nèi)容主要包括：采樣目的、對象、時間、部位、標(biāo)本量、無菌要求（一般不需要）、標(biāo)本保存與運輸條件等，并需根據(jù)現(xiàn)場實際情況進行必要的調(diào)整明確采樣要求現(xiàn)場采樣標(biāo)本采集應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)生物安全規(guī)定進行保護醫(yī)務(wù)和疾控人員現(xiàn)場采樣標(biāo)本采集應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)生物安全規(guī)定進行現(xiàn)場采樣血標(biāo)本-血清需采集多份血清標(biāo)本至少急性期（發(fā)病7d內(nèi)或發(fā)現(xiàn)時）恢復(fù)期（與急性期間隔2-3周）分別采集外周靜脈血各5ml～6ml，分離后的血清分裝于3個塑料螺口血清管中一份0.5ml左右，用于即將開始的檢測一份檢測備份一份留存監(jiān)測病種現(xiàn)場采樣血標(biāo)本-血清監(jiān)測病種現(xiàn)場采樣呼吸道標(biāo)本上呼吸道標(biāo)本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、痰液下呼吸道標(biāo)本：包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、胸水、肺組織活檢標(biāo)本消化道標(biāo)本患者的糞便和肛拭子要求：發(fā)病早期即開始采集，根據(jù)病程決定采集的頻次，采好的標(biāo)本分裝于3個螺口塑料試管中現(xiàn)場采樣呼吸道標(biāo)本現(xiàn)場采樣培訓(xùn)現(xiàn)場采樣培訓(xùn)現(xiàn)場采樣其它人體標(biāo)本包括腦脊液、皰疹液、淋巴結(jié)穿刺液等采集好的標(biāo)本分裝于3個螺口塑料試管中現(xiàn)場采樣其它人體標(biāo)本尸體解剖不明原因疾病的死亡病例盡可能采集死亡病例的所有組織器官應(yīng)根據(jù)疾病的臨床表現(xiàn)，采集與疾病有關(guān)的重點組織器官標(biāo)本（如肺、肝穿刺）做病原學(xué)研究的組織標(biāo)本采集得越早越好，疑似病毒性疾病的標(biāo)本采集時間最好不超過死后6h病理檢查的標(biāo)本不超過24h同種組織每一部位至少采集3份標(biāo)本，1份用于病原學(xué)研究（無菌采集），1份用于病理學(xué)研究（固定于福爾馬林中），1份用于電鏡檢查（固定于電鏡標(biāo)本保存液中）重要的組織器官應(yīng)多部位同時采集標(biāo)本現(xiàn)場采樣尸體解剖現(xiàn)場采樣媒介和動物標(biāo)本疑似蟲媒傳染病或動物源性傳染病現(xiàn)場采樣媒介和動物標(biāo)本現(xiàn)場采樣現(xiàn)場采樣做好樣品標(biāo)記樣品標(biāo)記非常關(guān)鍵，是所有標(biāo)本辨識的唯一標(biāo)志，絕對不能出現(xiàn)任何錯誤標(biāo)本采集過程中，應(yīng)保證采樣記錄表登記、采樣日志記錄與樣品標(biāo)記同時進行，并確保編號一一對應(yīng)樣品編號需要在標(biāo)本容器表面與容器蓋頂上同時進行標(biāo)記，避免容器與蓋子錯配，造成標(biāo)本的交叉污染現(xiàn)場采樣做好樣品標(biāo)記發(fā)熱伴血小板減少綜合征監(jiān)測采集標(biāo)本血清血凝塊血漿白細胞發(fā)熱伴血小板減少綜合征監(jiān)測采集標(biāo)本背景2004年以來，浙江、安徽、江蘇、山東、河南、湖北等省相繼報告一些以發(fā)熱伴血小板減少為主要表現(xiàn)的感染性疾病病例，其中少數(shù)重癥患者可因多臟器衰竭損害，救治無效死亡2004年，浙江、安徽等省局部地區(qū)發(fā)現(xiàn)發(fā)熱、血小板減少散發(fā)病例，實際發(fā)病數(shù)不詳，病因不明2005年5月，江蘇報告發(fā)熱、血小板減少散發(fā)病例，實際發(fā)病數(shù)不詳，病因不明2005年9月，湖北省咸寧市報告6例聚集性不明原因發(fā)熱病例，首發(fā)病例死亡，5為續(xù)發(fā)病例為首發(fā)病例的親屬，發(fā)病前均有在護理首發(fā)病例過程中接觸首發(fā)病例嘔出血液史。該起疫情也未能明確病原背景2004年以來，浙江、安徽、江蘇、山東、河南、湖北等省相背景2006年11月，安徽省廣德縣報告10例聚集性發(fā)熱伴血小板減少的病例，首發(fā)病例死亡，診斷為“疑似流行性出血熱”在其診療和護理的醫(yī)務(wù)人員和家屬接觸者中出現(xiàn)9例病例，其中醫(yī)務(wù)人員4例，家屬5例。續(xù)發(fā)病例具有首發(fā)患者嘔出血液和其他分泌物暴露史背景2006年11月，安徽省廣德縣報告10例聚集性發(fā)熱伴血小經(jīng)檢測確診為嗜吞噬細胞無形體病。這是我國首次確認(rèn)人粒細胞無形體病此后山東、安徽、河南等省也相繼有疑似無形體病報告ZhangLijuan,etal.JAMA2008,300(19):2263-2270經(jīng)檢測確診為嗜吞噬細胞無形體病。這是我國首次確認(rèn)人粒細胞無形背景2007年3-9月，河南省信陽市及其周邊地區(qū)共報告79例疑似無形體病病例，死亡10例。針對該起疫情的病原學(xué)檢測未能做出明確結(jié)論2009年3-10月，湖北隨州、黃岡等6個市共報告疑似無形體病病例93例，6例死亡（其中隨州58例、黃岡18例）。經(jīng)實驗室檢測，嗜吞噬細胞無形體均為陰性，1例病例查菲埃里克體陽性背景2007年3-9月，河南省信陽市及其周邊地區(qū)共報告79例背景疾病特點多為急性起病，多數(shù)患者伴有乏力、納差、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀，部分患者出現(xiàn)黑便、牙齦出血、皮膚瘀點或瘀斑、眼結(jié)膜充血等出血癥狀。絕大多數(shù)患者白血病不高或降低、血小板減少，部分患者谷丙/谷草轉(zhuǎn)氨酶升高、尿蛋白陽性。病例均發(fā)生在丘陵地區(qū)，發(fā)病時間集中在5-10月。男性多于女性，且多為農(nóng)民。20歲以下及80歲以上人群未見發(fā)病。背景疾病特點背景病毒細菌立克次體埃里克體無形體背景病毒發(fā)熱伴血小板減少綜合征監(jiān)測采集標(biāo)本血清血凝塊血漿白細胞發(fā)熱伴血小板減少綜合征監(jiān)測采集標(biāo)本標(biāo)本保存血清可在4℃存放3d、-20℃以下長期保存。用于病毒等病原分離和核酸檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快進行檢測24h內(nèi)能檢測的標(biāo)本可置于4℃保存，24h內(nèi)無法檢測的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存標(biāo)本保存血清可在4℃存放3d、-20℃以下長期保存。用于病毒標(biāo)本運送要嚴(yán)格做到生物安全依據(jù)病因分析的病原體分類，如果為高致病性病原微生物，應(yīng)嚴(yán)格按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務(wù)院424號令）和《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（中華人民共和國衛(wèi)生部第45號令）、《人間傳染的病原微生物名錄》等有關(guān)規(guī)定執(zhí)行標(biāo)本運送要嚴(yán)格做到生物安全標(biāo)本檢測與解釋標(biāo)本的預(yù)處理血清滅活病毒性疾病的實驗室檢測方法可分為三類，即直接檢測、間接檢測和血清學(xué)檢測標(biāo)本檢測與解釋標(biāo)本的預(yù)處理標(biāo)本檢測與解釋直接檢測直接檢測臨床標(biāo)本中病毒顆粒、病毒抗原或病毒核酸方法電鏡/免疫電鏡檢測、組織中包涵體檢查、IFA/ELISA檢測抗原、病毒核酸/基因組檢測等特點一般在標(biāo)本采集、送達的當(dāng)天或次日就可得到結(jié)果，這對于需要根據(jù)實驗室檢測結(jié)果進行臨床處置和盡早采取防控措施極為重要，但對標(biāo)本的要求也較高，病變部位標(biāo)本的陽性結(jié)果比其它部位的陽性結(jié)果診斷意義大得多標(biāo)本檢測與解釋直接檢測標(biāo)本檢測與解釋標(biāo)本檢測與解釋標(biāo)本檢測與解釋抗原檢測常用方法免疫熒光試驗（IF）、雙抗體夾心ELISA法等IF優(yōu)點：快速、易于操作缺點：敏感性和特異性較低IF試驗對標(biāo)本質(zhì)量的要求較高由于在結(jié)果判定時有一定主觀性，需要檢測人員具有較豐富的經(jīng)驗雙抗體夾心ELISA法比IF復(fù)雜，但敏感性和特異性較高標(biāo)本檢測與解釋抗原檢測標(biāo)本檢測與解釋核酸檢測已經(jīng)成為病毒性疾病實驗室診斷中最常用的方法，發(fā)揮著越來越重要的作用，核酸檢測的方法多種多樣，主要包括兩類不進行病毒核酸擴增的探針雜交法核酸擴增的方法：PCR/RT-PCR/Real-timePCR）、基于核酸序列的擴增（如NASBA）標(biāo)本檢測與解釋核酸檢測已經(jīng)成為病毒性疾病實驗室診斷中最常用的標(biāo)本檢測與解釋特點敏感性極高、簡便、快速，Real-timePCR還可以定量檢測高通量、多病原快速檢測標(biāo)本檢測與解釋特點標(biāo)本檢測與解釋間接檢測—病毒分離細胞培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)雞胚接種尿囊腔卵黃囊….動物接種標(biāo)本檢測與解釋間接檢測—病毒分離標(biāo)本檢測與解釋血清學(xué)檢測在病毒學(xué)實驗室中使用最為普遍，如急性期血清中特異性IgM、IgA、IgG檢測等血清學(xué)檢測的方法多種多樣，多數(shù)病毒性感染通常都可以采用血清學(xué)檢測的方法加以診斷雙抗原夾心ELISA法、間接ELISA、單擴溶血試驗（SRH）、中和試驗（NT）、IgM抗體捕捉ELISA法、免疫層析法等標(biāo)本檢測與解釋血清學(xué)檢測標(biāo)本檢測與解釋IgM抗體捕捉ELISA法和免疫層析法主要用于血清中IgM的檢測IFA、雙抗原夾心ELISA法、間接ELISA和單擴溶血試驗（SRH）用于檢測血清中全抗體/IgG/中和抗體（四倍及四倍以上增高）標(biāo)本檢測與解釋IgM抗體捕捉ELISA法和免疫層析法主要用于標(biāo)本檢測與解釋NT在一些病毒難于分離的病毒性疾病實驗室檢測中，成為實驗室確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”標(biāo)本檢測與解釋NT在一些病毒難于分離的病毒性疾病實驗室檢測中標(biāo)本檢測與解釋病毒性疾病的實驗室檢測絕非通過一種檢測方法就能夠解決，一般都是通過兩種或兩種以上檢測共同完成的質(zhì)控SOP先進方法與傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法的改良標(biāo)本檢測與解釋病毒性疾病的實驗室檢測絕非通過一種檢測方法就能平陰縣人民醫(yī)院(PingyinPeople’sHospital)

平陰縣中醫(yī)院(PingyinTraditionalChineseMedicineHospital)文登市婦幼保健院(WendengMaternityandChildCareServiceCenter)文登市中心醫(yī)院(WendengCentralHospital)文登開發(fā)區(qū)醫(yī)院(WendengDevelopmentzoneHospital)唾液樣品質(zhì)量控制SalivaSampleQualityControl對855份唾液樣品進行RNasePPCR檢測，占已檢測樣品總數(shù)的25.08%（855/3409），其中陰性5份，占0.58%（5/855)，有效樣本達到99.42%（850/855)平陰縣人民醫(yī)院平陰縣中醫(yī)院文登市婦幼保健院文登市中DBS樣品質(zhì)量控制DBSSampleQualityControl對724份DBS樣品進行RNasePPCR檢測，占已檢測樣品總數(shù)的22.04%（724/3285），其中陰性1份，占0.14%（1/724)，有效樣本達到99.86%（723/724)平陰縣人民醫(yī)院(PingyinPeople’sHospital)

平陰縣中醫(yī)院(PingyinTraditionalChineseMedicineHospital)文登市婦幼保健院(WendengMaternityandChildCareServiceCenter)文登市中心醫(yī)院(WendengCentralHospital)文登開發(fā)區(qū)醫(yī)院