市場營銷第3章基因工程第1節(jié)基因工程工具酶wangjx

市場營銷第3章基因工程第1節(jié)基因工程工具酶wangjx第一節(jié)基因工程中的工具酶限制性內切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細胞的破壁，轉化，核酸純化，檢測等一、限制性內切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類（二）、限制性內切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類1.

I型：由三個基因構成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個基因構成一個復合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點。2.

II型：限制與修飾基因產物獨立起作用，在Ｅ.coli中這兩種基因位于質粒上。3.

III型：修飾酶與Ｉ型酶相同，hsdＭ與hsdＳ基因產物結合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。

上述三個系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。（二）、限制性內切酶的定義、命名

1.定義：廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶；狹義指II型限制酶。

2.

命名：限制酶由三部分構成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：HindⅢ前三個字母來自于菌種名稱H.influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)（三）、限制酶的特點

1.識別順序和酶切位點１）識別４-8個相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外側，產生５’-端突起２）富含ＧＣ

３）對稱性—雙對稱

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切點大多數(shù)在識別順序之內，也有例外５）限制酶切后產生兩個末端，末端結構是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.

末端種類

１）３’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’

粘性末端能與另一個相同的粘連末端相連接，任何兩個具有相同識別位點的DNA分子經限制酶切割后能夠重新連接成新的重組DNA分子。在進行DNA重組時，應用限制酶同時切割目的基因和載體DNA，使之產生相對的粘性末端，然后再將二者連接成重組DNA分子

３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補的粘性末端ａ）切點在識別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識別序列HaeⅠ的識別序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識別序列和酶切切口（平端）酶切條件：酶切緩沖液低鹽組：0～50mmol/LNaCl中鹽組：50～100mmol/LNaCl高鹽組：100～150mmol/LNaCl（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶2.特點：1）識別相同順序2）切割位點的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

（五）、限制酶的用途

1.

DNA重組2.

限制酶（物理）圖譜繪制3.

突變分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切與完全酶切附：IIS型限制酶的特點1.

具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結構。2.

酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側，1--20nt。3.

酶切后的末端經補平后又可發(fā)生酶切反應。4.

產生粘性末端可以是1--5個核苷酸。5.

均為單體，分子量為47—108kD。酶切圖譜的構建（a）請構建該環(huán)狀DNA分子的酶切圖譜酶切圖譜的構建（b）二、DNA甲基化酶

（一）、甲基化酶的種類與識別順序1.

限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶三個系統(tǒng)中的甲基化酶可使細菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤。在DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同M．HpaICmCGGHpaICCGG相同2.

II型甲基化酶對限制酶活性的影響

１）

抑制同種限制酶的活性

M.BamHIGGATmCC—BamHI(G

GATCC)M.EcoRIGAmATTC—EcoRI(G

AATTC)

２）

抑制不同種限制酶的活性a.順序完全重疊如：M.ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）b.順序邊界重疊如：M.BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）

３）

抑制不同種限制酶的部分活性M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.

甲基化酶的用途

１）

改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成２）

在建立基因文庫時，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭RE用于基因組文庫的建立用于cDNA的連接RERERE三、核酸酶

（一）、外切酶III（ExoIII）

1.一般特點：

來自于E.coli，分子量28,000kD

2.催化反應類型

1)外切酶活性：3’→

3.

外切酶活性特點

1)反應底物：互補ds-DNA2)堿基釋放速度：C>>A-T>>G3)反應產物：5’-單磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，過度反應將導致DNA降解

4.

用途

1)

核酸（DNA）標記2)

基因突變----缺失3)

DNA序列測定時作順序缺失

5.

使用注意事項

1)

正式使用前，測定在一定條件下酶的反應速度2)

在一定條件下，ExoIII不能作用GC富集區(qū)(來自于cDNA加尾)ds-DNA結構:切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'5'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HOOH3'OH3'OH3'OH3'P5'P5'P5'P5'P5'P5'P5'3'HOP5'OH3'P5'RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于順序缺失ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA標記（二）、RNase（三）、RNaseH（二）、RNase

大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質合成系統(tǒng)中的RNA分子。

1.RNaseA

分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（100℃加熱15min仍具活性）,用于除去DNA樣品中的RNA分子

2.核酸酶S7，亦稱微球菌核酸酶，對RNA敏感，用于除去蛋白質合成系統(tǒng)中的內源mRNA

（三）、RNaseH

作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去RNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。

（四）、DNaseI1.特點：具內切酶活性，作用于ds-DNA，但無核苷酸序列特異型，產生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活達最大值當酶濃度很低時，ds-DNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關，Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置

2.用途

1)切口移位，制備DNA探針2)制備RNA樣品時除去DNA分子3)基因突變時產生切口

Mn++存在時

Mg++存在時

DNaseI作用特點DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位PolI四、聚合酶包括DNA聚合酶和RNA聚合酶（一）、E.coliDNA聚合酶I（polI）

1.E.coli的DNA聚合酶系統(tǒng)

PolI參與DNA修復,具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII同上具3’→5’外切酶活性polIII參與DNA復制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

2.E.colipolI的特點

1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應條件的影響3）外切酶活性

3.用途

1）除去3’-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時）2）補齊5’-突起端3）合成第二條cDNA4）切口移位制備探針其中用途2)和3)常用大片段（二）、T4DNA聚合酶

1.特點：

5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,為polI的兩倍3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分別為40和4000nt/min,缺少5’到3’的外切核酸酶活性.

2.

用途：

制備高比活性探針(1010cpm/μgDNA);DNA末端修飾---缺失

外切酶活性

聚合酶活性

無dNTPdNTP(三)T7噬菌體DNA聚合酶具3’到5’端外切核酸酶活性和持續(xù)合成能力較低的DNA聚合酶活性.應用:1)合成DNA能力很強,可用于延伸很長的模板.2)可用于定點誘變中互補鏈的合成.3)3’末端的標記4)將雙鏈DNA的黏性末端轉變?yōu)槠蕉?（四）、TaqDNA聚合酶1.特點：

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應溫度75℃，對95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途：

主要用于DNA的體外擴增，經25次循環(huán)后才進入酶的反應穩(wěn)定期，一個DNA分子因而可被擴增4×106倍。DNA擴增技術又稱為聚合酶鏈式反應，它包括以下三個步驟：DNA模板變性(95℃)→

與DNA引物退火(45℃)→引物延伸(75℃)

TaqPol和PCR

5’3’變性

3’5’

5’3’引物

3’5’復性

5’3’5’3’

3’5’引物3’5’5’3’延伸

5’3’3’5’

3’5’

(五)不倚賴于模板的DNA聚合酶末端轉移酶特點:催化dNTP到DNA的3’羥基端,不需要模板,但需要2價陽離子.應用:1)克隆DNA片段.同聚物加尾.2)用32P標記DNA的3’末端.3)在DNA的3’末端摻入非放射性的標簽.4)合成多脫氧核苷酸同聚體.(六)倚賴RNA的DNA聚合酶反轉錄酶合成cDNA克隆補平和標記5’端突出的DNA片段的3’末端.代替Klenow酶(七)倚賴DNA的RNA聚合酶噬菌體的RNA聚合酶:SP6,T7和T3應用:產生均勻標記的高比活性單鏈RNA探針(原位雜交)(八)不倚賴DNA的RNA聚合酶poly(A)聚合酶應用:用32P標記RNA的3’端加尾(poly(A)五、連接酶（一）、T4DNA連接酶

1.特點：

只連接ds-DNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基

2.用途：

1)相同或相容粘性末端的連接2)平整末端的相連DNA平端來源：限制酶作用結果;限制酶與其它酶共同作用結果。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多

5’-AAGCTT-3’5’-AOH

PAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAP

HOA-5’HOATTCGAP