細(xì)胞傳代、鋪板、凍存、復(fù)蘇等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)操作步驟和注意事項(xiàng)

細(xì)胞傳代、鋪板、凍存、復(fù)蘇等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)2020年9月16日細(xì)胞污染鋪板不勻密度不合適

問(wèn)題：狀態(tài)不佳1.細(xì)胞傳代3.細(xì)胞鋪板4.細(xì)胞凍存5.細(xì)胞復(fù)蘇目錄細(xì)胞傳代原因及概念：培養(yǎng)的細(xì)胞由于細(xì)胞增殖，密度過(guò)大，出現(xiàn)接觸抑制，導(dǎo)致細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，甚至死亡，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，以一定的比例轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為細(xì)胞傳代。細(xì)胞傳代的步驟（貼壁細(xì)胞為例）首先，鏡下觀察細(xì)胞密度，90%以上即可傳代培養(yǎng)（為了細(xì)胞的穩(wěn)定，距離上一次傳代至少間隔一天。）。準(zhǔn)備工作：無(wú)菌槍頭、培養(yǎng)瓶、離心管、廢液桶等所需物品，培養(yǎng)基、血清、PBS、胰酶等試劑類，可根據(jù)情況，提前放入生物安全柜，進(jìn)行紫外滅菌；細(xì)胞傳代的步驟（貼壁細(xì)胞為例）把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到生物安全柜中，吸去培養(yǎng)基，加入無(wú)菌PBS（只要沒(méi)過(guò)即可），輕輕搖動(dòng)清洗細(xì)胞，盡量棄盡PBS。加入1ml胰酶細(xì)胞消化液，放入培養(yǎng)箱，并計(jì)時(shí)，不確定消化時(shí)間的，需隨時(shí)鏡下觀察，待細(xì)胞從完全鋪展開(kāi)的貼壁狀態(tài)，變成即將懸浮的小亮點(diǎn)時(shí)，為最佳。迅速移至生物安全柜，加入等體積的完全培養(yǎng)基，終止消化，全面輕柔吹打，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至無(wú)菌離心管中，離心1000轉(zhuǎn)，3-5min。準(zhǔn)備新的培養(yǎng)瓶，加入新鮮的完全培養(yǎng)基4-6ml。離心完畢，輕輕倒掉，加入完全培養(yǎng)基，輕柔吹散，吸取500ul細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)，混勻，放入培養(yǎng)箱。細(xì)胞處理過(guò)程一切無(wú)菌操作均需在生物安全柜中進(jìn)行

無(wú)菌培養(yǎng)基、PBS、試劑等；無(wú)菌離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)

皿、槍頭等，在生物安全柜中方能打開(kāi)。手消毒：75%乙醇/酒精棉球隨時(shí)消毒。細(xì)胞操作過(guò)程中，及時(shí)蓋上蓋子（培養(yǎng)皿/板、離心管、培養(yǎng)基等）。操作時(shí)，手部和胳膊不要從已開(kāi)蓋的無(wú)菌細(xì)胞、培養(yǎng)基等上方略過(guò)。培養(yǎng)基、PBS、血清等分裝使用。無(wú)菌試劑、槍頭、廢液桶等提前擺放得當(dāng)，以便于操作。X?細(xì)胞鋪板常規(guī)的細(xì)胞傳代步驟，至細(xì)胞消化后離心完畢，用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。根據(jù)需要鋪板的數(shù)量，用無(wú)菌離心管或者培養(yǎng)瓶，配制完全培養(yǎng)基（可多配1-2ml）。吸取適量的細(xì)胞懸液，加入到配制的完全培養(yǎng)基中，吹打使充分混勻，立即等量加入到培養(yǎng)板的每個(gè)孔中。充分搖勻后，輕輕轉(zhuǎn)移入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)器皿面積（cm2）培養(yǎng)液量（ml）100%細(xì)胞量（105）（約）96孔板0.320.1148孔板0.950.22.524孔板1.910.5512孔板3.831106孔板9.52253.5cm培養(yǎng)皿9.62206cm培養(yǎng)皿21.355210cm培養(yǎng)皿58.11013725cm培養(yǎng)皿2555075cm培養(yǎng)皿7515-30200培養(yǎng)板需要加入培養(yǎng)基的體積以及細(xì)胞數(shù)量各種規(guī)格細(xì)胞培養(yǎng)板需要加入的培養(yǎng)基的體積，可以參考下表。細(xì)胞培養(yǎng)板中加入細(xì)胞的數(shù)量，需要考慮一下幾點(diǎn)：1.

常規(guī)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)：轉(zhuǎn)染siRNA（約30%-50%），轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（約70%-80%），還要綜合考慮轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞密度的要求等。2.細(xì)胞生長(zhǎng)的速度，細(xì)胞的大小，細(xì)胞處理的時(shí)間長(zhǎng)度（24h，48h...）。3.根據(jù)后續(xù)相應(yīng)檢測(cè)試劑盒的要求（CCK-8,細(xì)胞周期，流式，熒光染色等）。培養(yǎng)板需要加入的細(xì)胞量培養(yǎng)板中細(xì)胞數(shù)量的控制：1.按照經(jīng)驗(yàn)：一個(gè)培養(yǎng)瓶100%滿后，大概可鋪n個(gè)6孔板（2n個(gè)12孔板...）等,結(jié)合鏡下觀察，調(diào)整濃度。2.

計(jì)數(shù)細(xì)胞：參考前文中各種規(guī)格中100%滿時(shí)細(xì)胞的大概數(shù)量，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求，計(jì)算加入的細(xì)胞的數(shù)量。（使用計(jì)數(shù)板）干凈的蓋玻片0.1ul細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用計(jì)算公式：n/4x104

（個(gè)/ml）注意:避免有氣泡！10-20ul細(xì)胞懸液數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右計(jì)數(shù)板中每一方格的面積為0.01cm2，高為0.01cm，這樣它的體積為0.0001cm3，即0.1mm3。由于1ml=1000mm3，所以每一大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)×10000=細(xì)胞數(shù)/ml，故可按下式計(jì)算：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/mL=4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000。細(xì)胞鋪板均勻的注意事項(xiàng)1.細(xì)胞消化離心后，盡量在離心管中吹打均勻后，迅速加入到培養(yǎng)板中。2.最好每加完一個(gè)培養(yǎng)板后，吹打混勻一次，再加入到下一個(gè)培養(yǎng)板中（對(duì)于96孔板，每加三到四行/列后，吹打混勻一次）。3.細(xì)胞加入到培養(yǎng)板中后，在操作臺(tái)上，沿大8字輕輕搖勻，靜置數(shù)分鐘，或者立即平行轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在此過(guò)程中，切記不可晃動(dòng)培養(yǎng)板，不可撞擊等劇烈動(dòng)作。4.其他：輕輕移動(dòng)他人的細(xì)胞，輕輕關(guān)閉培養(yǎng)箱的門等細(xì)胞凍存準(zhǔn)備工作：FBS，完全培養(yǎng)基，DMSO，或無(wú)血清凍存液，凍存管，凍存盒。常規(guī)的細(xì)胞傳代步驟，至細(xì)胞消化后離心完畢，根據(jù)細(xì)胞的量以及需要凍存的管數(shù)配制凍存液；凍存液：10%DMSO+90%FBS/完全培養(yǎng)基（A），或者無(wú)血清凍存液（B）。凍存程序：A

：1.使用凍存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天轉(zhuǎn)移入液氮罐中。

2.不使用凍存盒：需要梯度降溫，4℃（30min-1h），-20℃（30min），-80℃

過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)移入液氮罐中。

B

：使用無(wú)血清凍存液：可直接放入-80℃，可長(zhǎng)期保存于-80℃冰箱。細(xì)胞復(fù)蘇提前打開(kāi)水浴鍋，設(shè)置溫度37℃。從冰箱取出完全培養(yǎng)基，置于室溫復(fù)溫。依次把培養(yǎng)瓶/皿、槍頭盒、離心管，置于生物安全柜中，紫外照射15-30min。待紫外結(jié)束，首先，在培養(yǎng)瓶/皿中，加入適量的完全培養(yǎng)基，并做好標(biāo)記。從液氮罐或者負(fù)80冰箱，迅速取出凍存細(xì)胞，轉(zhuǎn)移入37℃水浴鍋，使其迅速解凍（1min之內(nèi)）。解凍后，