Survivin基因真核表達載體的構(gòu)建及其在cos

Survivin基因真核表達載體的構(gòu)建及其在cos【摘要】［目的］克隆人survivin基因并在真核細(xì)胞中表達。［方法］以人喉癌組織中提取總RNA為模版，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈RT-PCR法獲得survivincDNA。將該基因克隆到載體中,構(gòu)建真核細(xì)胞表達載體/survivin，將測序正確的survivin基因通過脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染cos-7，Westernblot檢測survivin蛋白在cos-7中表達。［結(jié)果］DNA測序證明獲得了survivin基因，其序列與GeneBank中報道序列完全一致。Westernblot檢測survivin蛋白獲得高效表達，其相對分子質(zhì)量為。［結(jié)論］Survivin基因的克隆和表達均獲得了成功，為進一步探討survivin基因在喉癌診治中應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】survivin基因人喉癌組織基因表達

ConstructionofSurvivinEukaryoticExpressionVectorandItsExpressionincos-7

Abstract:［Purpose］Tocloneandexpresshumansurvivingenewitheukaryoticvector.［Methods］TotalmRNAwasextractedfromhumanlaryngealcancertissue,andthenthefull-lengthsurvivincDNAwasobtainedbyRT-PCR.Thesurivingenewasclonedintovectorandthe/survivinvectorwasconstructedandtransfectedintocos-7cells.Thesurvivinproteinwasanalyzedbywesternblot.［Results］ThecDNAofsurvivinwassequencedandconsistentwiththesequencereportedinGenebankwithblast。Westernblotanalysisdemonstratedthatthesurvivinproteinwasexpressedandtherelativedmolecularmasswasabout［Conclusions］survivingenehasbeenclonedandexpressedsuccessfullyandcanbeusedforfurtherstudytheapplicationsofsurvivinondiagnosisandtherapyinthelaryngealcancer.

Keywords:survivingene;eukaryoticexpression;vectorconstruction

Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAP)家族的成員，其功能主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細(xì)胞凋亡過程。該蛋白選擇性地表達于胚胎發(fā)育組織和人類大多數(shù)腫瘤組織，而正常成人終末組織中不表達，其獨特的分布特點在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用已受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。為了進一步探討該基因在人喉癌組織中的表達及其在喉癌診斷及預(yù)后判斷中的作用，我們構(gòu)建了survivin基因的真核表達載體并將其轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞以觀察該基因在其中的表達情況，為下一步喉癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

材料

人新鮮喉癌組織、質(zhì)粒和猴成纖維細(xì)胞cos-7細(xì)胞系及DH5α菌株均為本科保存。限制性內(nèi)切酶及胰蛋白酶購于寶生物工程(大連)有限公司；T4DNA連接酶、DNA純化試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司，用于組織總RNA提取的TripureIsolationReagent提取試劑盒購于Gibco公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineReagent2000和G418購于Gibco公司，survivin兔抗人多克隆抗體購自于Santacruz公司。

方法

PCR引物設(shè)計

根據(jù)GeneBank中survivin序列，設(shè)計一對引物，P1(survivin基因上游引物，5′GCCGGTACCATGGGTGCCCCGACG；3′P2(survivin基因下游引物，5′GCCCTCGAGTCAATCCATGGCAGC3′。在上游和下游引物5′端分別加入了BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，以便于克隆。引物由上海博亞生物有限公司合成。

目的基因survivin片段的獲得

取手術(shù)切除的人新鮮喉癌組織，機械搗碎后，消化收集、洗滌、沉淀，以TripureIsolationReagent總RNA試劑提取總RNA(詳見試劑操作說明)，按產(chǎn)品說明書操作，以反轉(zhuǎn)錄體系經(jīng)RT-PCR制備survivincDNA，反應(yīng)如下:取總RNA1μｇ，oligadT2μl，混勻后70℃10min，冰浴2min后加5倍逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5μl，10mmol/LdNTP2μl，RNA酶抑制劑2μl，逆轉(zhuǎn)錄酶(MLVRT)40Ｕ，混勻后42℃水浴60min，冰浴2min，70℃加熱10min后模板制備完畢。以所制備survivincDNA為模板進行35個PCR反應(yīng)擴增，反應(yīng)體系如下:模板cDNA8μl，10倍緩沖液10μl，25mmol/LMgCl210μl，上、下游引物(10ｐｍｏｌ/Ｌ)4μl，TagDNA聚合酶2μl，10mmol/LdNTP2μl，加Ｈ2Ｏ補足至總體積100μl。反應(yīng)條件為:94℃5min，52℃2min，72℃2min后94℃1min，52℃1min，72℃2min，35個循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸10min。取5μlPCR產(chǎn)物，在含/Ｌ溴化乙錠(EB)的瓊脂糖凝膠(15ｇ/Ｌ)中電泳分析，紫外觀測儀觀察結(jié)果。

Survivin基因的克隆及真核載體/survivin的構(gòu)建

回收純化的產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切并回收,取10μl回收片段，加經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切的質(zhì)粒2μl，加T4DNA連接酶1μl、10×bufferＤ2μl、雙蒸水5μl，4℃過夜進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為/survivin。取連接產(chǎn)物10μl轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α100μl，與ＬＢ培養(yǎng)液混勻,倒入含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，用涂菌棒均勻涂平，置37℃孵箱過夜。用牙簽隨機挑取單個菌落，置搖菌管中，37℃恒溫振蕩器搖菌16ｈ。移菌液至離心管中，離心棄上清,按試劑盒說明書介紹進行質(zhì)粒的抽提和純化。同時取1ml菌種送上海生工測序。抽提純化的重組質(zhì)粒4μl，加10×bufferＤ1μl，BamHⅠ和XhoⅠ各μl，雙蒸水4μl，置37℃恒溫箱進行酶切1ｈ，進行瓊脂糖凝膠電泳。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

cos-7細(xì)胞在含100ml/Ｌ新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70%左右，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將重組質(zhì)粒/survivin進行轉(zhuǎn)染，具體方法參照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。Ｇ418(濃度為500μｇ/ml)篩選。

Westernblot印跡

分別取3×107個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體(+)及重組質(zhì)粒/survivin的cos-7細(xì)胞，裂解后加入3×加樣緩沖液混勻，沸水中煮10min，離心，經(jīng)15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在轉(zhuǎn)移槽中將蛋白從凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上(電壓14Ｖ，冷室內(nèi)過夜)，麗春紅染液預(yù)染并標(biāo)記蛋白分子量。TBST緩沖液洗膜、封閉過夜。加TBST緩沖液稀釋的兔抗人survivin多克隆抗體(1∶200)作為一抗，37℃孵育15ｈ，加堿性磷酸酶標(biāo)記IgG(1∶400)作為二抗，孵育、洗膜后，將膜浸入10ml堿性磷酸酶底物緩沖液與33μｌ四唑氮藍(lán)(NBT)和66μｌ(BCIP)制成的顯色液，室溫閉光顯色20min，蒸餾水終止反應(yīng)。

2結(jié)果

Survivin基因的獲得與鑒定

以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR電泳結(jié)果顯示一條約為425ｂｐ大小的特異性條帶。此DNA帶與survivin基因的大小相符合(425ｂｐ)，圖中未見有其他非特異擴增帶出現(xiàn)(圖1)。將該DNA帶回收后，DNA測序結(jié)果表明，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得的DNA片段為survivin基因，其DNA序列與GeneBank中報道的survivin基因序列吻合。

Survivin基因的克隆及真核表達載體/survivin的酶切結(jié)果

Survivin基因插入表達載體后，提取獲得的重組質(zhì)粒/survivin，以雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有一425bp的條帶為轉(zhuǎn)染基因survivin產(chǎn)物。

Survivin蛋白表達

將正確的重組菌在37℃活化過夜，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后做SDS分析，從電泳圖可以看出在表達蛋白理論相對分子質(zhì)量(×103)對應(yīng)處出現(xiàn)了一條新的表達帶。

3討論

近年來已陸續(xù)有文獻報道survivin蛋白在頭頸部腫瘤組織中的表達[1~3]，本文通過分子生物學(xué)方法克隆擴增喉癌組織中survivin基因，構(gòu)建真核表達載體，并轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞，為下一步研究survivin基因并探索腫瘤的生物治療奠定基礎(chǔ)。

Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡抑制因子，屬于凋亡抑制蛋白家族的新成員，是迄今發(fā)現(xiàn)最強的一種凋亡抑制蛋白，主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細(xì)胞凋亡過程，而且能在細(xì)胞有絲分裂前期通過與紡錘體微管發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞周期Ｇ2/Ｍ期檢測點的監(jiān)控，抵抗因DNA損傷和突變自身誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常分裂增殖。Survivin主要表達于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，同時高表達于多種腫瘤組織和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在成人各種正常器官中檢測不到。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、口腔鱗癌、鼻咽癌和造血系統(tǒng)腫瘤中survivin均過度表達[5，6]。由于survivin僅特異性地表達于腫瘤組織，在正常成人組織幾乎不表達，使得應(yīng)用survivin特異性抗體作免疫治療、決定基因突變以及反義survivin基因治療具有良好的靶向性、特異性及安全性，具有成為喉癌治療的潛在新靶點[7，8]。

我們以人喉癌組織總RNA為模板，擴增survivin基因，插入原核表達載體，成功地表達了survivin蛋白。不僅證實了survivin在喉癌組織中有表達，而且為進一步研究其在喉癌及其他惡性腫瘤的診斷、靶向性治療及預(yù)后判斷中的應(yīng)用意義奠定了基礎(chǔ)。

但有關(guān)survivin促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的許多環(huán)節(jié)還不清楚。隨著對survivin研究的進一步深入，survivin在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制必將進一步闡明，而survivin的靶向腫瘤療法及針對性開發(fā)新的抗腫瘤藥物對腫瘤的治療將具有深遠(yuǎn)的意義。

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