滅活方法對(duì)冰核活性細(xì)菌活性的影響

滅活方法對(duì)冰核活性細(xì)菌活性的影響

自1973年首次報(bào)道冰核活性細(xì)菌（簡(jiǎn)稱ia）以來。1材料和方法1.1材料表面1.1.1rbicola培養(yǎng)模式草生歐文氏菌10025A(Erwiniaherbicola)來源于中國林業(yè)科學(xué)院森林保護(hù)研究所。Xanthomonascampestris206菌株,本實(shí)驗(yàn)室從天津市地區(qū)蔬菜葉表分離。1.1.2培養(yǎng)基MPDA培養(yǎng)基見文獻(xiàn)1.1.3超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)HYG-Ш型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜,JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),J2-21型低溫冷凍離心機(jī),HC21006型低溫恒溫器,玻璃組織研磨器,721分光光度計(jì)等。1.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)方法1.2.1.mpda液體培養(yǎng)基將活化后的冰核活性細(xì)菌10025A斜面菌種接入到30mlMPDA液體培養(yǎng)基中再活化一代后,按2%的接種量接種到MPDA液體培養(yǎng)基中,在31℃,180r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)至18℃下繼續(xù)培養(yǎng)2h。將培養(yǎng)物在4000r/min下低溫離心30min,磷酸緩沖液(50mmol/L,pH=7.0)洗滌兩次后按一定體積懸浮,測(cè)定細(xì)菌懸液細(xì)胞濃度和冰核活性。1.2.1.細(xì)菌懸液處理及活菌計(jì)數(shù)和凍滴率的測(cè)定將含有30ml菌懸液的小燒杯置于冰浴中,超聲波輸出功率為400W、超聲時(shí)間2s,間隙時(shí)間2s,設(shè)計(jì)不同的細(xì)菌懸液濃度和總的超聲處理時(shí)間,定時(shí)取樣進(jìn)行顯微鏡觀察并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和凍滴率的測(cè)定。1.2.1.3-輻射處理按前述方法制備細(xì)菌懸液后,分別將70ml細(xì)菌懸液置于無菌三角瓶中,包扎好后送到天津市物理所輻照中心進(jìn)行輻射處理,采用的輻射源為1.2.1.超聲波配合處理按前述方法制得細(xì)菌懸液后離心,菌體重新懸浮于溶菌酶濃度為1mg/ml的0.001mol/L的磷酸緩沖液(含0.001mol/LEDTA,0.25mol/L蔗糖)中,28℃下靜置2h,然后激烈震蕩或置于超聲波中配合超聲波進(jìn)行處理,然后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和凍滴率的測(cè)定。1.2.1.活菌計(jì)數(shù)和凍滴率的測(cè)定將細(xì)菌懸液置于冰箱冷凍室中(-18℃)凍結(jié)24h后取出,室溫下緩慢解凍,無菌操作吸取2ml用于活菌計(jì)數(shù)和凍滴率的測(cè)定,其余繼續(xù)凍結(jié)24h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和凍滴率的測(cè)定。1.2.1.活菌計(jì)數(shù)和凍滴率的測(cè)定將一定體積得到的濕菌體移入研磨器中,加入2g石英沙,研磨30min后用一定體積的磷酸緩沖液洗出菌體并懸浮,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和凍滴率的測(cè)定。1.2.2測(cè)量1.2.2.1.冷凍率的測(cè)量采用Lindow改進(jìn)的小液滴法1.2.2.2.活細(xì)菌計(jì)算方法在MPDA平板上采用傾注法測(cè)定冰核細(xì)菌數(shù)2結(jié)果與討論2.1超聲破裂法對(duì)冰核細(xì)菌的死亡和冰核活性的影響2.1.1超聲處理時(shí)間對(duì)1005a冰核菌的死亡率和冰核活性的影響超聲波輻射時(shí)間是影響細(xì)菌細(xì)胞破碎死亡效果的重要因素。本實(shí)驗(yàn)研究了細(xì)胞濃度為1.4×102.1.2超聲處理中的細(xì)胞濃度對(duì)10025a的死亡率和冰核活性的影響選取不同細(xì)胞濃度的菌液(1.4×102.1.3聲波法處理由于溶菌酶可以使細(xì)菌細(xì)胞壁水解,導(dǎo)致細(xì)胞壁疏松或細(xì)胞破碎。因此采用溶菌酶配合超聲波法處理冰核細(xì)菌,以期獲得更高的死亡率。結(jié)果見圖5,該方法使細(xì)菌死亡率提高到99.11%,溶菌酶的加入雖然對(duì)冰核活性影響不大(見表2,溶菌酶法),但并未使死亡率達(dá)到100%的效果,成本的增加大于效果的提高,不太適合實(shí)際應(yīng)用。2.2輻射處理對(duì)冰核細(xì)菌死亡率和冰核活性的影響溶菌酶法、研磨法和凍融法對(duì)冰核細(xì)菌死亡率和冰核活性的影響結(jié)果見表1。溶菌酶法可使細(xì)菌死亡率達(dá)到90.7%,研磨法和凍融法的細(xì)菌死亡率相對(duì)都較低,凍融法還造成凍滴率的顯著下降,可見上述方法均不可取。采用輻射法對(duì)前面所用冰核細(xì)菌10025A和另一株具冰核活性的黃單胞菌屬的206菌株進(jìn)行滅活處理,考察輻射處理對(duì)冰核細(xì)菌死亡率和冰核活性的影響,結(jié)果見表2。冰核細(xì)菌10025A兩種菌懸液經(jīng)過20kGy輻射劑量的照射后細(xì)菌全部死亡,樣品液在平板上培養(yǎng)幾天仍無菌生長,樣品液的凍滴率稍有下降。提高劑量到25kGy以上時(shí),輻射后的原處理液冰核活性極度下降,OD600nm值為0.1的稀釋液的冰核活性為零。206菌株的兩種菌懸液經(jīng)過25kGy輻射劑量照射后,在計(jì)數(shù)培養(yǎng)的第1d天沒有生長,第2d開始有大量菌生長。因輻射作用機(jī)制主要是使微生物DNA受損,從而使細(xì)胞喪失繁殖能力,但206菌株對(duì)DNA受損有很強(qiáng)的修復(fù)能力,所以表現(xiàn)出上述特性,這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道3輻射處理對(duì)冰核細(xì)菌死亡率的影響探討了幾種滅活方法對(duì)冰核活性細(xì)菌死亡率和冰核活性的影響,結(jié)果表明:超聲波破碎法可以使冰核細(xì)菌10025A死亡率達(dá)到98%以上,但冰核活性也有所下降。輻射處理可使冰核細(xì)菌達(dá)到100%的死亡率,不同菌種對(duì)輻射的敏感程度不同,冰核活性的變化也有所不同,冰核細(xì)菌10025A在20kGy輻射劑量下100%