rnai技術(shù)沉默nrf2基因?qū)筩pe對(duì)beas-1b細(xì)胞毒性作用

rnai技術(shù)沉默nrf2基因?qū)筩pe對(duì)beas-1b細(xì)胞毒性作用

多環(huán)芳烴（pahs）是煤焦瀝（ctp）的主要成分。長期接觸大量pahs后，會(huì)出現(xiàn)各種損傷，如氧化、反應(yīng)形成和微核率增加。1材料和方法1.1pcr和反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)CTPE由中國鋁業(yè)股份有限公司河南分公司提供;G418、瓊脂糖(美國Invitrogen公司);定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司];兔抗Nrf2、NQO1、β-actin一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔-IgG(英國Abcam公司)。BEAS-2B細(xì)胞由鄭州大學(xué)特聘教授吳衛(wèi)東老師饋贈(zèng),用含體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)5%CO1.2rnai欠缺鑒定篩選BEAS-2B細(xì)胞株對(duì)氨基糖苷類抗生素G418最低耐受濃度;對(duì)GenBank上公布的人Nrf2核苷酸序列設(shè)計(jì)4條RNA抑制靶序列(分別標(biāo)記Nrf2-1、Nrf2-2、Nrf2-3、Nrf2-4),1條陰性對(duì)照序列(記為shNC)及1條陽性對(duì)照序列(記為shGAPDH)進(jìn)行RNAi-Mate轉(zhuǎn)染,篩選出沉默Nrf2基因的最佳序列,熒光顯微鏡觀察及RT-PCR驗(yàn)證其結(jié)果。利用最佳濃度的G418篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Nrf2重組質(zhì)粒,將細(xì)胞分為目的基因?qū)嶒?yàn)組、空白對(duì)照組、G418對(duì)照組和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組。由RT-PCR測(cè)定Nrf2mRNA相對(duì)表達(dá)量,將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)并凍存。1.3細(xì)胞毒性檢測(cè)當(dāng)BE-AS-2B細(xì)胞生長融合至70%左右時(shí),PBS沖洗2遍,更換新的完全培養(yǎng)基5mL,將細(xì)胞分為二甲基亞砜(DMSO)陰性對(duì)照組、B(a)P陽性對(duì)照組、CTPE染毒組和Nrf2轉(zhuǎn)染組。分別吸取10μL的DMSO溶液、以10μL2.5g/LDMSO為溶劑配制的B(a)P母液、7.5μL2g/L的CTPE,加入到5mL新鮮完全培養(yǎng)基充分混合的溶液,反復(fù)吹打使培養(yǎng)基與該染毒物充分混勻后處理上述分組的細(xì)胞。24h后常規(guī)傳代培養(yǎng),如此反復(fù)3次,最后一次染毒結(jié)束后首次傳代定為第1代。Nrf2轉(zhuǎn)染組在傳代過程中每隔5代進(jìn)行一次轉(zhuǎn)染,并一直應(yīng)用半數(shù)抑制濃度60%的G418完全培養(yǎng)基維持。1.4瓊脂糖和2培養(yǎng)基的制備用3g/L胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,并用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕吹打,使之成為單細(xì)胞,用PBS制備12和7g/L2個(gè)質(zhì)量濃度的低熔點(diǎn)瓊脂糖液,按1∶1(體積比)比例使12g/L的瓊脂糖和2×培養(yǎng)基(含有2×抗生素和體積分?jǐn)?shù)20%的小牛血清)混合后,6孔板中每孔注入2mL作底層瓊脂,置于CO1.5pcr檢測(cè)genrf2和nqo1的dna序列各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24~48h后提取細(xì)胞總RNA,細(xì)胞總RNA的提取嚴(yán)格按照RNAisoPlus試劑說明書進(jìn)行,引物寡核苷酸序列參照GenBank中Nrf2和NQO1的DNA序列,委托寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)并合成,以GAPDH作內(nèi)參照。同一樣本均設(shè)3個(gè)平行樣,PCR儀自動(dòng)繪制擴(kuò)增曲線和溶解曲線。反應(yīng)程序設(shè)定:預(yù)變性95℃,10min,然后95℃,5s;55℃,15s;72℃,15s,擴(kuò)增20~30個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序設(shè)定:95℃,1min;55℃,30s;95℃,30s,1個(gè)循環(huán)。采用21.6電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、防治各組細(xì)胞按試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白,各組標(biāo)本加入蛋白上樣緩沖液行SDS電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL發(fā)光顯色。采用KONDA2000凝膠成像系統(tǒng)成像,用GENESNAP軟件統(tǒng)計(jì)各條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參照,計(jì)算目的基因與內(nèi)參照吸光度的相對(duì)比值。1.7細(xì)胞內(nèi)nrf2、nqo1mrna和蛋白表達(dá)的比較采用SPSS21.0進(jìn)行分析,應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞克隆形成率、不同代次各組細(xì)胞中Nrf2、NQO1mRNA和蛋白表達(dá)的差異,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1nrf2-1組rnai最佳序列的檢測(cè)見圖1。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況,第1天各孔細(xì)胞生長良好,形態(tài)正常;第7天濃度為400mg/L的孔中細(xì)胞密度低于50%;第13天細(xì)胞全部凋亡、脫壁;因此400mg/L為G418最佳篩選濃度。Nrf2-1組(0.150±0.009)、Nrf2-2組(0.345±0.014)、Nrf2-3組(0.414±0.016)、Nrf2-4組(0.237±0.014)Nrf2mRNA表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組(1.001±0.107),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=149.399,P<0.001),Nrf2-1組與陽性對(duì)照組(0.144±0.015)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);故選Nrf2-1組為RNAi最佳序列。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后,siRNA組(0.147±0.002)Nrf2mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照(1.026±0.297)、G418對(duì)照組(0.993±0.032)和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(1.211±0.085),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.291,P<0.001)。2.2表1顯示了軟瓊氏體的形成2.3表2顯示了不同代組中nr2和nqo1mnm的發(fā)現(xiàn)2.4不同世代組的npr2和nqo1蛋白的發(fā)現(xiàn)見圖2及表3。誘導(dǎo)后(CTPE組)第10代、20代、30代細(xì)胞中Nrf2與NQO1的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r3使用老年酸在細(xì)胞毒性作用環(huán)境中毒物的種類眾多,如空氣污染物、有機(jī)溶劑、金屬和類金屬等,其中,多數(shù)毒物均可引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。為應(yīng)對(duì)外來有毒化學(xué)物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損害,哺乳動(dòng)物在不斷進(jìn)化過程中體內(nèi)逐漸形成了一套復(fù)雜的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)。而Nrf2是經(jīng)典的調(diào)控機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子,Nrf2在激活后可誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá),提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力,在保護(hù)細(xì)胞和組織免受活性氧自由基損害中起著重要的作用NQO1是一種重要黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的黃素蛋白酶類,能夠調(diào)控磺胺類、苯醌類以及多環(huán)芳烴類化合物等的代謝,具有多重細(xì)胞保護(hù)作用。B(a)P作用于小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞后,可以通過增強(qiáng)Sp1-AhR-Nrf2信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)使過氧化氫酶過度表達(dá)從而上調(diào)NQO1的表達(dá)綜上所述,Nrf2在CTPE誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生惡變過程中是抑癌基因;且NQO1和Nrf2蛋白表達(dá)呈正相關(guān),表明Nrf2可能